非小細(xì)胞肺癌組織MIP-1表達(dá)及其與樹突狀細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系

彭大勇,李東斌,李 俊,文 亢,趙文靜

(江蘇省南京市上海梅山醫(yī)院,1.腫瘤科;2.病理科,江蘇南京,210039)

非小細(xì)胞型肺癌包括鱗癌、腺癌、大細(xì)胞癌,與小細(xì)胞癌相比其癌細(xì)胞生長(zhǎng)分裂較慢,擴(kuò)散轉(zhuǎn)移相對(duì)較晚,非小細(xì)胞肺癌約占肺癌總數(shù)的80%～85%[1-2]。趨化因子是指具有吸引白細(xì)胞移行到感染部位的一些低分子量趨化因子(多為8-10KD)的蛋白質(zhì)(如 IL-8、MCP-1等),在炎癥反應(yīng)中具有重要作用[3-4]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)[5],巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1(MIP-1)可以增加黏合素在中性粒細(xì)胞上的表達(dá),參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡及組織損傷等過程,目前MIP-1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展已成為了近代研究的熱點(diǎn)。本項(xiàng)目通過研究肺癌組織的MIP-1表達(dá)與浸潤(rùn)樹突狀細(xì)胞表面趨化因子受體CCR1、CCR7表達(dá)的關(guān)系,旨在初步探討肺癌的免疫逃逸機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2007年2月～2010年6月來本院胸外科進(jìn)行手術(shù)治療的74例非小細(xì)胞肺癌作為研究對(duì)象,患者術(shù)前均未實(shí)施放療或化療。74例肺癌患者中男 56例,女 18例,年齡 35～72歲,平均(56.8±7.9)歲。經(jīng)病理學(xué)檢查:鱗癌31例,腺癌26例,大細(xì)胞癌12例,其他類型 5例;按照 1997年國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)修訂的標(biāo)準(zhǔn),本研究對(duì)患者進(jìn)行TNM分期:Ⅰ期13例,Ⅱ期31例,Ⅲ期25例(ⅢA期16例,ⅢB期5例),Ⅳ期5例。

1.2 試劑

CCR1,CCR7多克隆抗體及MIP-1原位雜交檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海朗頓生物技術(shù)有限公司,其余生化試劑均購(gòu)自上海朗晟生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)[6]:標(biāo)本均采用10%的中型甲醛進(jìn)行固定,采用甲醛固定的石蠟法進(jìn)行包埋。采用SYD-S2020切片機(jī)切成約5 μ m的薄片,以PBS洗滌2次,每次5 min;再采用二甲苯及梯度乙醇脫蠟至水,抗原微波修復(fù),3%H2O2(80%甲醇)滴加在 TMA上,室溫靜置10 min,再以PBS洗滌2～3次;滴加正常山羊血清封閉液,室溫20 min,甩去多余液體,滴加Ⅰ抗 50 μL,室溫靜置1 h或者4℃過夜或者37℃1 h,PBS洗3次各 5 min;滴加Ⅱ抗 40～50 μL,室溫靜置,或37℃1 h,二抗中可加入0.05%tween-20,PBS洗3次各5 min;最后加入抗CCR7多克隆抗體,4℃過夜,再依次加入二抗及卵白素過氧化物酶,DAB顯色;以滴加PBS液代替Ⅰ抗作陰性對(duì)照。

1.3.2 熒光原位雜交[7]:嚴(yán)格按照博士德公司說明書MIP-1原位雜交檢測(cè)方法進(jìn)行操作,首先將切片脫蠟至水化,再在切片上滴加3%檸檬酸稀釋的胃蛋白酶消化液,37℃消化處理15 min,然后再以適量蒸餾水進(jìn)行沖洗,繼續(xù)以1%低聚甲醛室溫固定10 min。雜交過程,在每張切片上滴加20 μL雜交液,放置于38℃恒溫箱內(nèi)進(jìn)行雜交過夜。雜交結(jié)束后,在37℃溫度下,采用SSC洗脫液進(jìn)行洗滌,程序如下:2×SSC洗脫液處理 2次,每次2 min,0.5×SSC洗滌處理2 min,0.2×SSC洗滌處理15 min,最后滴加適量過氧化物酶,于37℃條件下室溫30 min,最后采用PBS進(jìn)行洗滌。

2 結(jié) 果

2.1 肺癌組織中MIP-1、CCR1、CCR7表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,MIP-1陽性染色細(xì)胞為胞膜或胞質(zhì)有綠色熒光物質(zhì)表達(dá),癌旁組織中無MIP-1陽性染色細(xì)胞出現(xiàn)。CCR1、CCR7陽性表達(dá)細(xì)胞,為棕黃色或棕褐色,細(xì)胞形態(tài)各異,呈不規(guī)則樣分布,有些細(xì)胞表面具有較多突起,少許腫瘤細(xì)胞核個(gè)體較大、胞質(zhì)也比較豐富,與樹突狀細(xì)胞形態(tài)存在顯著性差別。

2.2 肺癌組織中MIP-1 、CCR1、CCR7表達(dá)與肺癌分期關(guān)系

隨機(jī)抽取Ⅲ、Ⅳ期及Ⅰ、Ⅱ期肺癌組織MIP-1、CCR1、CCR7陽性染色切片,將每張切片上陽性染色細(xì)胞計(jì)數(shù),取平均值。具體數(shù)據(jù)見表1,Ⅲ、Ⅳ期肺癌組織中MIP-1陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)量顯著多于Ⅰ、Ⅱ期,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ⅲ、Ⅳ期肺癌組織中CCR1陽性樹突狀細(xì)胞數(shù)量明顯多于Ⅰ、Ⅱ期,Ⅲ、Ⅳ期肺癌組織中CCR7陽性樹突狀細(xì)胞數(shù)量明顯少于Ⅰ、Ⅱ期,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明 MIP-1、CCR1和CCR7陽性樹突狀細(xì)胞的表達(dá)和肺癌分期相關(guān)。

表1 不同臨床分期患者肺癌組織中MIP-1 、CCR1、CCR7陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)(n=10,個(gè))

2.3 肺癌組織MIP-1與CCR1,CCR7陽性樹突狀細(xì)胞表達(dá)的關(guān)系

肺癌組織MIP-1陽性表達(dá)與CCR1陽性樹突狀細(xì)胞呈正相關(guān)(r=0.1427,P=0.017);肺癌組織MIP-1陽性表達(dá)與CCR7陽性細(xì)胞浸潤(rùn)呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.2148,P=0.023)。

3 討 論

MIP-1屬趨化因子CC家族,是趨化因子受體CCR1的配體,在炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮越來越重要的作用。目前,關(guān)于趨化因子的研究已經(jīng)成為當(dāng)今國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一,它可以快速誘導(dǎo)炎性細(xì)胞應(yīng)答與介導(dǎo)免疫細(xì)胞募集和活化。

MIP-1對(duì)單核細(xì)胞具有趨化活性,可以通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)激活單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞。活化的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的包漿內(nèi)鈣離子濃度升高,超氧陰離子濃度升高,并可以釋放溶菌酶,進(jìn)而上調(diào)黏附分子表達(dá)水平和相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生,抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。除了對(duì)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的作用外,MIP-1還可以對(duì)嗜堿性粒細(xì)胞發(fā)揮趨化和激活的作用,導(dǎo)致其脫顆粒和釋放組胺增加。處于啟動(dòng)、調(diào)控、并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。CCR1,CCR7為樹突狀細(xì)胞表面兩個(gè)重要的標(biāo)記分子,CCR1通過與其配體MIP-1的結(jié)合激發(fā)一系列生化反應(yīng),改變周圍細(xì)胞的黏附性,便于將細(xì)胞信號(hào)定位到腫瘤部位。趨化因子受體CCR7(CC chemokine receptor 7)在多種免疫細(xì)胞上表達(dá),它及其配體在引導(dǎo)這些細(xì)胞向淋巴組織或器官歸巢中起主導(dǎo)作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)[8-9],CCR7在惡性腫瘤細(xì)胞上高度表達(dá),并且在腫瘤細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),肺癌組織MIP-1表達(dá)中可檢測(cè)到表面表達(dá)CCR1及CCR7的樹突狀細(xì)胞,且Ⅲ、Ⅳ期肺癌組織中樹突狀細(xì)胞CCR1陽性表達(dá)顯著高于Ⅰ、Ⅱ期。分析可能的原因是MIP-1通過趨化功能,吸引更多未成熟樹突狀細(xì)胞到達(dá)腫瘤局部,而這些細(xì)胞無法激發(fā)腫瘤特異殺傷性T細(xì)胞,甚至誘導(dǎo)產(chǎn)生無能T細(xì)胞,從而導(dǎo)致機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)相對(duì)較弱,具體的機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究證實(shí)。

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