抗HCCR單克隆抗體的制備及其鑒定

郝 波,林 艷,張國新,施瑞華

(南京醫科大學第一附屬醫院消化實驗室,江蘇南京,210029)

人宮頸癌癌基因(HCCR)是由韓國學者Ko等[1]運用差異顯示RT-PCR方法從宮頸癌組織和宮頸癌細胞株中篩選出的一種癌基因。該基因定位于人染色體12q,按照分子特性不同該基因可分為HCCR-1和HCCR-2兩種亞型,HCCR2缺乏HCCR1中的外顯子1。其相應的蛋白為選擇剪接變構體,其中HCCR1編碼360個氨基酸的多肽,分子量為42 kDa;HCCR2編碼304個氨基酸,分子量為36 kDa[2]。研究報道[3]盡管HCCR發現于人宮頸癌,但在宮頸癌患者血清中未見升高,在肝癌患者血清中卻異常升高。本研究利用HCCR重組蛋白免疫BALB/c小鼠,制備抗人HCCR單克隆抗體(mAb),并進行相關鑒定,為進一步深入研究HCCR的生物學功能和致癌相關機制打下實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

重組pMBP-c-HCCR-His融合蛋白由本課題組制備,內含MBP和His雙重標簽[4]。人肝癌細胞株HepG2購自中國科學院上海細胞所,小鼠骨髓瘤SP2/0細胞系由南京醫科大學衛生部抗體技術重點實驗室惠贈。8周齡清潔級BALB/c雌性小鼠,由南京大學模式動物研究所提供。IPTG、HT和HAT培養基、完全/不完全弗氏佐劑、聚乙二醇、PEG4000和ImmunoType鼠mAb分型試劑盒為Sigma公司產品。蛋白A免疫親和層析柱為Pharmacia公司產品。1640培養基購自Invitrogen公司。胎牛血清購自hyclone公司。FITC標記的羊抗鼠熒光二抗購自Inc.,Eugene。

1.2 方法

1.2.1 免疫BALB/c小鼠:①取1g純化的HCCR融合蛋白進行10%SDS-PAGE,再電轉移到PVDF膜上,切下含相應蛋白的PVDF膜,采用脾內包埋法,包埋到5只8周齡BALB/c小鼠脾內。②2周后加強免疫,將HCCR蛋白(50 g/只)與福氏不完全佐劑充分乳化,按0.2 mL/只腹腔注入BALB/c小鼠內。③2周后再次加強免疫,10 d后眼靜脈放血0.2 mL,分離血清,ELISA方法檢測小鼠血清中的抗體效價,Western blot方法檢測其特異性。細胞融合前3 d,再次腹腔注射3×106/只,進行加強免疫。

1.2.2 雜交瘤細胞的制備和篩選:常規制備飼養細胞,接種96孔培養板,1×105個細胞/孔。取最后一次加強免疫后的小鼠脾細胞,采用PEG 4000細胞融合法,將處于生長旺盛期、外觀形態良好的小鼠骨髓瘤細胞SP2/0與小鼠脾細胞按1∶5的比例進行融合。融合后的細胞以HAT培養基繼續培養,5 d后用HAT培養基換出1/2培養基,10 d后以HT培養基進行選擇培養。HT培養液培養1周,再換成常規含10%胎牛血清RPMI1640培養液培養,待倒置顯微鏡下可見大的細胞克隆形成時,用間接ELISA法檢測細胞上清以篩選陽性克隆:分別用純化蛋白MBP-HCCRHis和MBP-His進行包備,取抗體檢測MBPHCCR-His(+)/MBP-His(-)的陽性孔細胞再進行兩次克隆化培養,將兩次檢測皆為陽性的細胞立即進行克隆化培養。選取生長良好,分泌穩定的雜交瘤細胞株進行擴大培養,凍存保種。

1.2.3 抗人HCCR mAb制備和純化:取10周齡的BALB/c小鼠,腹腔注射0.5 mL無菌液狀石蠟。1周后,取生長旺盛的其中1株雜交瘤細胞,用PBS調整濃度為2×105個/mL,無菌條件下將雜交瘤細胞注入小鼠腹腔,5～10 d采集腹水離心,12000 r/min,5 min,除去細胞成分和其他沉淀物,收集上清,用間接ELISA檢測純化單抗效價。10 mL腹水加等量的結合緩沖液(1.5 mol/L甘氨酸,pH 9.0)稀釋后,過 Protein ASepharoseC L-4B親和層析柱,上樣結束用結合緩沖液洗柱直到雜蛋白洗凈,再用洗脫液(0.2 mol/L甘氨酸,pH3.0)洗脫,分管收集流出液,并用Tris-Cl(1 mol/L,pH 9.0)進行中和,然后測量紫外280 nm的OD值,合并蛋白質高峰管,用PBS透析。

1.2.4 抗人HCCR mAb生物學特性的分析和鑒定:①抗人HCCRmAb亞型的鑒定:取雜交瘤細胞培養上清液,用 Roch公司提供的 IsoS-tripTM鼠mAb亞類檢測試劑盒進行IgG亞類鑒定。具體操作過程按照說明書進行。②抗人HCCR mAb的特異性鑒定:Western-blot法:將純化的重組人HCCR蛋白(分別加入蛋白2.0、4.0、8.0 μ g/每孔)進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后,電轉至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉1 h。用抗人HCCR mAb(1∶400)4℃條件下過夜,加入羊抗鼠IgG-HRP抗體(1∶5000稀釋),室溫下孵育1 h,用ECL化學發光法顯影。細胞免疫熒光:常規培養肝癌細胞HepG2,進行細胞爬片,丙酮固定20 min,滴加3%的H2O2溶液1滴,室溫下孵育15 min。滴加抗人HCCR一抗(1∶200稀釋),37℃恒溫箱孵育1 h。PBS洗滌后滴加FITC標記的羊抗小鼠IgG(1∶100稀釋)進行孵育30 min,熒光顯微鏡下觀察結果。

1.2.5 間接 ELISA法的建立:以5 μ g/mL HCCR蛋白進行包被,采用間接ELISA法檢測HCCR蛋白的最佳配伍HCCR抗體。

2 結 果

2.1 特異性分泌鼠抗人HCCR mAb的雜交瘤細胞株的建立

免疫BALB/c小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞在HAT選擇性培養基中培養融合10天后,經有限稀釋法進行亞克隆和克隆后,成功篩選出2株分泌抗人HCCR mAb的雜交瘤細胞株,分別進行編號和凍存。3個月后雜交瘤細胞株經液氮凍存多次復蘇傳代,仍生長良好,分泌抗體性能穩定。

2.2 腹水效價的測定及抗人HCCR mAb的純化

收取小鼠腹水,經蛋白A親合層析純化和透析后獲得抗人HCCR mAb。用間接ELISA檢測腹水和純化單抗效價,以未免疫的小鼠血清為陰性對照,根據吸光度值/陰性對照測定值≥2.1,判定腹水中效價為1∶106,純化單抗效價1∶105(圖 1)。

圖1 ELISA法測定效價

2.3 單克隆抗體性質和特異性鑒定

抗人HCCR mAb亞類鑒定:結果顯示為IgG1類。Western-blot檢測結果:通過Western-blot分析,在42KD位置出現特異性條帶,表明純化抗人HCCR mAb可與HCCR蛋白特異性結合,提示制備的抗人HCCR mAb具有較好的特異性(圖2)。

圖2 HCCR單克隆抗體Western-blot檢測結果

2.4 細胞免疫熒光

結果顯示肝癌HepG2細胞中胞漿和胞膜均呈陽性染色,而胞核未見染色(圖3)。

圖3 肝癌HepG2細胞免疫熒光染色 400倍

2.5 間接ELISA法的靈敏度

根據吸光度值/陰性對照測定值≥2.1的判定標準,通過間接ELISA方法檢測不同稀釋度的HCCR抗體,其檢測靈敏度可達到1 μ g/L。

3 討 論

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一,其患者死亡率高且預后差,嚴重威脅著人類健康。目前甲胎蛋白(AFP)檢測仍是血清學診斷肝癌的主要手段,但該方法仍有一定的局限性[5-6]。因此尋找更特異、敏感的腫瘤血清學標志物和診斷方法對肝癌的診斷、療效的判定、腫瘤的復發及患者生存期的判斷具有重要意義。

目前文獻報道[3]HCCR可在白血病、乳腺癌、腎癌、胃癌、結腸癌、肝癌和子宮癌等多種腫瘤中過量表達,提示HCCR在腫瘤的發生中起重要的作用,并且發現HCCR可能是肝癌、乳腺癌早期診斷的標志物[7]。進一步研究研究發現用含HCCR-1的pcDNA3質粒穩轉NCI-H460和RKO細胞可使抑癌基因p53異常高表達,但與p53相關基因 p21WAF1、MDM2、Bax表達下調或失活,表明HCCR可作為P53的負性調節蛋白促進腫瘤的發生、發展[1]。Kim等[3]利用ELISA檢測570例血清標本發現HCCR對肝細胞癌的診斷敏感性為78.2%,特異性為95.7%,而AFP敏感性為僅64.6%。52例AFP陰性的肝癌患者中40例HCCR顯示為陽性,在直徑<2 cm肝細胞癌患者的陽性率為69.2%,比AFP陽性率要高,表明HCCR可以作為肝癌敏感的診斷標志物,特別在早期肝癌及小肝癌的敏感性可能優于AFP。

作者通過本實驗室自己制備的HCCR抗原免疫BALB/c小鼠,利用雜交瘤技術篩選并制備了兩株能分泌高效價抗HCCR mAb,為進一步對HCCR生物學功能和高效價抗體作用機制研究奠定了基礎。本研究在檢測雜交細胞上清時,分別用純化蛋白MBP-HCCR-His和MBP-His進行間接ELISA包被,成功篩選出MBP-HCCRHis(+)和MBP-His(-)細胞上清的陽性克隆孔,有效地避免MBP和His載體蛋白非特異反應的干擾,較好的增加了雜交瘤細胞的特異性。我們利用Western-blot和免疫熒光方法對HCCR mAb進行了初步驗證,結果顯示HCCR mAb可與HCCR蛋白特異性反應,表明本實驗室制備的HCCR mAb具有較高特異性。

綜上所述,本研究成功獲得了2株持續穩定分泌抗人HCCR mAb的雜交瘤細胞株,為進一步深入研究HCCR的生物學功能和致癌相關機制提供了物質基礎。

[1]Ko J,Lee Y H,Hwang S Y,et al.Identification and differ-ential expression of novel human cervical cancer oncogene HCCR-2 in human cancers and its involvement in p53 stabilization[J].Oncogene,2003,22:4679.

[2]Chung Y J,Kim J W.Novel oncogene HCCR:its diagnostic and therapeutic implications for cancer[J].Histol Histopathol,2005,20(3):999.

[3]Yoon S K,Lim N K,Ha S A,et al.The Human Cervical Cancer Oncogene Protein Is a Biomarker for Human Hepatocellular Carcinoma[J].Cancer Res,2004,64(15):5434.

[4]林 艷,楊 楊,張國新,等.人HCCR蛋白表達載體的構建、表達及其蛋白純化[J].南京醫科大學學報,2006,26(9):757.

[5]Colli A,Fraquelli M,Conte D.Alpha-fetoprotein and hepatocellular carcinoma[J].Am J Gastroenterol,2006,101(8):1939.

[6]Gupta S,Bent S,Kohlwes J.Test characteristics of alphafetoprotein for detecting hepatocellular carcinoma in patients with hepatitis C.A systematic review and critical analysis[J].Ann Intern Med,2008,139(1):46.

[7]Jung S S,Park H S,Lee I J,et al.The HCCR Oncoprotein as a BiomarkerforHuman Breast Cancer[J].Clin Cancer Res,2005,11(21):7700.