杏花雨對血管性癡呆大鼠行為及其海馬Bcl－2，Bax蛋白表達的影響

武變瑛，李利平，張新穎，王艷，巴衛松

（1．河北大學 基礎醫學院，河北 保定 071000；2．河北大學 中醫學院，河北 保定 071000；

3．石家莊市藥品檢驗所 質保科，河北 石家莊 050051；4．定州市人民醫院 藥劑科，河北 定州 073000）

杏花雨對血管性癡呆大鼠行為及其海馬Bcl－2，Bax蛋白表達的影響

武變瑛1，李利平1，張新穎2，王艷3，巴衛松4

（1．河北大學 基礎醫學院，河北 保定 071000；2．河北大學 中醫學院，河北 保定 071000；

3．石家莊市藥品檢驗所 質保科，河北 石家莊 050051；4．定州市人民醫院 藥劑科，河北 定州 073000）

為研究杏花雨對血管性癡呆大鼠行為學及大鼠海馬Bcl－2，Bax蛋白表達的影響，采用反復缺血再灌注＋硝普鈉方法復制出血管性癡呆（VD）動物模型，并觀察銀杏黃酮注射制劑杏花雨對VD大鼠的保護作用，采用Morris水迷宮檢測其行為學，免疫組織化學法檢測并觀察其海馬Bcl－2，Bax蛋白表達．研究結果顯示：與假手術組相比，模型組大鼠Bcl－2，Bax蛋白表達增加（P＜0．01），Bcl－2／Bax（陽性細胞數比值）顯著降低，經杏花雨a，b及金納多治療后，與模型組相比，VD大鼠認知能力顯著改善（P＜0．01），海馬CA1區Bcl－2陽性細胞數均有提高（P＜0．05），杏花雨b組有明顯提高（P＜0．01）；大鼠海馬CA1區Bax陽性細胞數降低，尤其以杏花雨b組降低明顯（P＜0．01），Bax／Bcl－2也較假手術組與模型組明顯提高（P＜0．05）．結果表明杏花雨可以改善血管性癡呆大鼠的認知能力，推測與Bcl－2，Bax蛋白表達有關．

血管性癡呆；杏花雨；銀杏黃酮；行為學；Bcl－2；Bax

銀杏葉是一種用途極為廣泛、不良反應極少的天然藥物．中國用其入藥已有上千年歷史，銀杏葉現代藥用開發始于20世紀60年代，其提取物（EGb）含銀杏萜內脂、銀杏黃酮等成分［1］，其中銀杏黃酮具有多種生理活性，除對心血管具有明顯的保護作用外，在神經系統中也有明顯療效，如保護神經細胞免受損傷，改善神經退行性改變和衰老，提高學習記憶功能等［2］．目前中國采用的EGb大多為口服制劑，針劑少見，進口注射制劑如德國產“金納多”由于價格昂貴不能普遍應用于基層．杏花雨注射液為河北醫科大學藥理教研室新研制的EGb注射劑，本研究采用的高純度銀杏黃酮注射制劑（杏花雨）采用特殊工藝分離銀杏葉提取物，使其有效成分銀杏黃酮甙的含量高達55%，高于國際通用標準1倍以上．根據黃酮甙含量不同分為杏花雨a及杏花雨b，銀杏葉提取物國際標準是黃酮甙≥24%，“金納多”剛符合國際標準，而杏花雨b黃酮甙的含量高達55%，杏花雨a這一指標與金納多持平，為24%，杏花雨注射液成本低廉．本文將通過實驗證實杏花雨有效成分的高低是否決定著產品的優劣．近年來隨著人口老齡化日趨明顯，血管性癡呆（vascular dementia，VD）的發病逐年增加，成為老年性癡呆的主要類型之一，該病具有潛在的可預防性，被稱為“可逆性癡呆”，因此探討VD的更加有效治療方法有重要的醫學價值．本實驗采用缺血再灌注法復制VD大鼠模型，用杏花雨注射液進行治療，金納多做為陽性對照藥，觀察銀杏黃酮的療效及作用機制．

1 材料和方法

1．1 動物

健康成年雄性Wistar大鼠72只，普通級，體重220～250 g，由河北醫科大學實驗動物中心提供，合格證編號：1103188．

1．2 主要藥物

杏花雨注射液由河北醫科大學藥理教研室提供，規格5 m L／支，分為杏花雨a，b 2種，其中杏花雨a黃酮甙含量為4 mg，杏花雨b黃酮甙含量為6．5 mg；金納多針劑由德國威瑪舒培博士藥廠出產（批號E8166），規格5 m L／支，內含黃酮甙4．2 mg．

1．3 試劑與儀器

Bcl－2一抗、兔超敏二步法免疫組化檢測試劑、DAB試劑盒，北京中杉金橋生物有限公司；MT＿200 Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統，成都泰盟科技有限公司；NIKON TS100倒置顯微鏡及Mias2000圖像分析系統，NIKON公司．

1．4 模型復制

采用雙側頸動脈缺血再灌注＋硝普鈉降壓法［3］制作VD模型，此法是先暴露大鼠雙側頸總動脈，穿線備用，先腹腔注射硝普鈉（3．5 mg／kg）造成低血壓，再用無創動脈夾加閉3次，每次10 min，再通10 min，最后1次再通30 min后縫合傷口，縫合前傷口處撒敷青霉素粉末，術后注意保溫與蘇醒老鼠的水分補充．假手術組只分離頸總動脈，不進行缺血再灌注手術．模型復制成功后除假手術組外，其余大鼠分別分為模型組、杏花雨a組、杏花雨b組、金納多組．第2天腹腔注射給藥，假手術組與模型組給予生理鹽水，其余3組給予對應藥物治療，劑量均為5 m L／kg，給藥時間共計21 d．

1．5 學習記憶功能的檢測

參照胡鏡清等［4］方法，采用Morris水迷宮實驗裝置及動態圖像采集分析系統進行學習記憶功能的檢測．Morris水迷宮裝置直徑為1．2 m，圓形逃逸平臺高為0．23 m，直徑為0．10 m，低于水面2～3 cm，將其放置于某一象限的中央．室溫24℃，水溫控制在（24±2）℃，屋頂和四壁表面干凈整潔，保持周圍環境的安靜．從給藥2周后開始，歷時7 d，第1天大鼠頭頂做紅色標記，以便計算機跟蹤，適應性游泳5 min，使其習慣環境和人的抓取等相關操作，從第2天起，將大鼠面向池壁分別從水池4個象限內的固定點放入水中，由計算機記錄大鼠由入水到平臺的逃避潛伏期時間．若大鼠在2 min內未找到平臺，需將其引導至平臺上，使其停留20 s，潛伏期計為2 min．

1．6 免疫組織化學

水迷宮實驗完成后第2天，迅速斷頭處死大鼠，取腦組織用冰中性PBS緩沖液沖洗后置于中性甲醛中固定48 h，脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋后5μm厚度切片，脫蠟脫水，經體積分數為3%的H2O2處理后進行微波熱修復15 min，冷卻至常溫，滴加一抗，濕盒內4℃孵育過夜，分別滴加試劑1，2，37℃孵育，DAB顯色，蘇木素輕度復染，脫水，透明，封片．400倍光鏡觀察，隨機選擇大鼠海馬CA1區5個視野，做免疫反應陽性細胞計數，以“個／視野”為單位，結果取5個視野的平均值．

1．7 圖像分析及統計學處理

用NIKON倒置顯微鏡和Mias2000圖像分析系統采集圖像并進行陽性細胞計數．在每張切片隨機選取5個相鄰視野，求出陽性細胞的平均值．用SPSS16．0統計軟件分析計算，以±s表示，組間比較采用單因素方差分析．

2 結果

2．1 手術組大鼠術后早期觀察

造模后大鼠外觀干癟，瘦弱拱背，毛發豎立且疏散并失去光澤，反應遲鈍，進食和運動明顯減少．可出現一側或雙側眼裂變小，共濟失調，但未見明顯肢體癱瘓．部分大鼠出現驚厥，抽搐后死亡，個別大鼠術中呼吸窒息死亡．數天后存活的大鼠恢復自由行動及飲食．

2．2 杏花雨對大鼠認知功能的影響

以大鼠的逃避潛伏期做為檢驗其學習能力的標準，隨訓練天數變化，潛伏期逐漸縮短或基本穩定，經統計學分析，水迷宮訓練第1天，各組大鼠逃避潛伏期與假手術組比較沒有差別；而第2天各組逃避潛伏時間明顯縮短，且模型組與各治療組之間有明顯差別（P＜0．05）；第3天開始成績比較穩定，與模型組比較，杏花雨b與假手術組逃避潛伏時間顯著縮短（P＜0．01），杏花雨a組與金納多組逃避潛伏時間明顯縮短（P＜0．05）；另外，與金納多組比較，杏花雨b組逃避潛伏期明顯縮短（P＜0．05），與杏花雨a組的逃避潛伏期比較，無明顯差別（P＞0．05），說明同等劑量下，杏花雨b組的療效較佳，結果見表1．

表1 各組大鼠逃避潛伏期測試成績（x±s）Tab．1 Rats of each group escape latency test scores（x±s）

2．3 各組大鼠海馬Bcl－2，Bax陽性細胞數免疫組化統計結果

表2顯示，假手術組大鼠海馬CA1區，可見少量Bcl－2，Bax陽性細胞表達，與假手術組相比，模型組海馬區Bcl－2，Bax數量明顯增多（P＜0．01），但Bax陽性細胞數變化更為顯著，Bcl－2／Bax（陽性細胞比值）明顯降低（P＜0．05）；杏花雨a，b組，金納多組大鼠海馬CA1區Bcl－2陽性細胞表達數均高于模型組，Bax陽性細胞表達數均低于模型組，與金納多組比較，杏花雨b組大鼠海馬CA1區Bcl－2陽性細胞表達數升高（P＜0．05），Bax陽性細胞數明顯降低（P＜0．05），Bcl－2／Bax明顯升高（P＜0．05），杏花雨a組大鼠海馬CA1區Bcl－2陽性細胞表達數升高，但差異無統計學意義（P＞0．05）；與模型組比較，杏花雨b組海馬區Bcl－2陽性細胞增多（P＜0．01），Bax陽性細胞減少（P＜0．01），Bcl－2／Bax比值顯著增大（P＜0．01），杏花雨a組和金納多組海馬區Bcl－2陽性細胞增多（P＜0．05），Bax陽性細胞減少（P＜0．05），Bcl－2／Bax比值明顯增大（P＜0．05）．

表2 杏花雨對各組大鼠海馬CAl區Bcl－2，Bax表達陽性細胞數的影響（x±s）Tab．2 Expression of Bcl－2，Bax positive cells number on each rat hippocampal of Xinghuayu effect（x±s）

2．4 各組大鼠海馬Bcl－2蛋白表達免疫組化染色結果

免疫陽性細胞質內出現棕黃色顆粒，著色越深陽性反應越強．圖1顯示：假手術組僅有少量或者無免疫陽性細胞，著色淺．模型組免疫陽性細胞數較假手術組明顯增多，著色加深．金納多組、杏花雨a組及杏花雨b組免疫陽性細胞數較模型組顯著增多，著色較深．

圖1 各組大鼠海馬Bcl－2蛋白表達免疫組化染色比較（×400）Fig．1 Rat hippocampal of each group Bcl－2 protein expression of immunohistochemical staining（×400）

2．5 各組大鼠海馬Bax蛋白表達免疫組化染色結果

免疫陽性細胞質內出現棕黃色顆粒，著色越深陽性反應越強，結果見圖2．假手術組，僅少見或者無免疫陽性細胞．模型組，免疫陽性細胞數較假手術組顯著增多，著色加深．金納多組、杏花雨a組及杏花雨b組，免疫陽性細胞數較模型組有所減少，著色也較淺．

圖2 各組大鼠Bax蛋白表達免疫組化染色比較（×400）Fig．2 Rat hippocampal of each group Bax protein expression of immunohistochemical staining（×400）

3 討論

本實驗采用大鼠雙側頸總動脈反復夾閉并再通，同時腹腔注射硝普鈉降低血壓的方法復制模型，此法可重復性、穩定性較好，其優點為手術操作簡單，動物創傷小，大鼠海馬細胞有明顯的變性、壞死甚至丟失，可導致大鼠學習記憶障礙明顯，而無明顯的運動系統損傷表現，死亡率較低，是目前較為理想的VD動物模型．

近30年來，在行為神經科學研究中，水迷宮成為最常用的實驗室研究工具之一．水迷宮實驗常被用于嚙齒類動物神經認知疾病模型的驗證和神經認知治療可行性的評估［5］．本實驗結果顯示VD模型可顯著延長逃避潛伏期，而杏花雨a，b 2組及金納多組卻可明顯改善大鼠的學習記憶能力，其中杏花雨a組改善明顯．另外，5組大鼠隨著訓練次數的增多，空間記憶能力增強，逃避潛伏期在縮短，說明學習鍛煉也可以增強記憶能力．

引起VD的重要原因之一為腦缺血致皮質和海馬損傷．VD發病時，海馬CAl區神經細胞存在細胞凋亡［6］，而Bcl－2家族是細胞凋亡機制中重要的調節因子，Bax做為這一家族中重要成員，是重要的促凋亡基因，其誘導凋亡的機制為Bax同源二聚體的形成，可以加速細胞死亡［7］．另外，Bax與Bcl－2的比值也決定著細胞在受到凋亡信號刺激后是否發生凋亡［8］．本研究顯示：假手術組大鼠海馬CA1區可見少量或無Bcl－2，Bax陽性細胞，模型組大鼠CA1區Bcl－2，Bax陽性細胞數量增多，其中Bax變化更為明顯，Bcl－2／Bax比值與假手術組相比明顯降低；經杏花雨a，b組及金納多治療后，大鼠海馬CA1區Bax陽性細胞數降低，尤其以杏花雨b組降低明顯，Bax與Bcl－2的比值也較假手術組與模型組明顯提高；大鼠海馬CA1區Bcl－2陽性細胞數均有提高，杏花雨b組有明顯提高．由此推測杏花雨通過抑制大鼠海馬促細胞凋亡基因Bax表達，促進原癌基因Bcl－2表達，Bax和Bcl－2陽性細胞增多，但Bcl－2與Bax比值增大，從而降低神經元對凋亡刺激的敏感性，減少海馬神經元的凋亡，提高VD大鼠學習記憶的能力．

目前臨床上治療血管性癡呆的有效藥物相對較少，且價格不菲．在抗腦缺血后神經細胞凋亡方面，許多關于中藥對影響神經細胞凋亡相關因素的干預研究顯示出了較好的發展空間．本實驗選擇中藥銀杏葉提取物杏花雨治療血管性癡呆，并探討其可能的抗細胞凋亡作用機制，旨在為其臨床應用提供實驗室依據．

［1］ 梁淑軒，孫漢文．銀杏葉資源開發利用研究進展［J］．河北大學學報：自然科學版，2003，23（2）：204－208．

LIANG Shuxuan，SUN Hanwen．Proceeding in application ofGinkgobilobaleaves［J］．Journal of Hebei University：Natural Science Edition，2003，23（2）：204－208．

［2］ 李利平，王全勝，吳艷萍，等．銀杏葉提取物對學習記憶功能保護作用的研究進展［J］．軍醫進修學院學報，2006，27（1）：67－69．

［3］ 王蕊，楊勤飛，唐一鵬，等．大鼠擬“血管性癡呆”模型的改進［J］．中國病理生理雜志，2000，16（10）：914－916．

［4］ 胡鏡清，溫澤淮，賴世隆，等．Morris水迷宮檢測的記憶屬性與方法學初探［J］．廣州中醫藥大學學報，2000，17（2）：117－118．

HU Jingqing，WEN Zehuai，LAI Shilong，et al．A preliminary study on the memory attribution and methodology in Morris water maze test［J］．Journal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，2000，17（2）：117－118．

［5］ 方松，余化霖．Morris水迷宮實驗中海馬相關空間學習記憶的研究進展［J］．國際病理科學與臨床雜志，2010，30（4）：321－326．

FANG Song，YU Hualin．Advances in the study on hippocampus－related spatial learning and memory in Morris water maze［J］．International Jornal of Pathology and Clinical Medicine，2010，30（4）：321－326．

［6］ HARTMAN R E，LEE J M，ZIPFEL G J，et al．Characterizing learning deficits and hippocampal neuron loss following transient global cerebral ischemia in rats［J］．Brain Research，2005，1043（1－2）：48－56．

［7］ 張新穎，武變瑛，范淑娟，等．與血管性癡呆大鼠學習記憶力相關的基因表達變化［J］．醫學研究與教育，2011，28（4）：78－83．

ZHANG Xinying，WU Bianying，FAN Shujuan，et al．Gene expression changes related the study memory of vascular dementia rats［J］．Medical Research and Education，2011，28（4）：78－83．

［8］ OUYMG Y B，GIFFIARD K G．Cellular neuroprotective mechamisms in cerebral ischemia：Bcl－2 family proteins and protection of mitochondrial function［J］．Cell Calcium，2004，36（3－4）：303－311．

（責任編輯：趙藏賞）

Effects of Xinghuayu on the behavior of vascular dementia rats and the expression of Bcl－2 and Bax protein of the rat hippocampus

WU Bian－ying1，LI Li－ping1，ZHANG Xin－ying2，WANG Yan3，BA Wei－song4
（1．College of Basic Medical Sciences，Hebei University，Baoding 071000，China；
2．College of Traditional Chinese Medicine，Hebei University，Baoding 071000，China；
3．Warranty Section，Pharmaceutical Inspection Institute of Shijiazhuang，Shijiazhuang，050051，China；
4．Department of Pharmacy，The People's Hospital of Dingzhou，Dingzhou 073000，China）

VD model was established by the method of repeated ischemia－Reperfusion plus Sodium Nitroprusside in Wistar rats and the protective effects of Xinghuayu were observed．The author analyzed the cognitive ability of rats with the Morris water maze，and the expression of Bcl－2 and Bax protein of the rat hippocampus with immunohistochemical staining．The results showed that compared with the pseudo－surgery rats，VD model had more increase in the expression of Bcl－2 and Bax protein of the rat hippocampus（P＜0．01）and significantly decreased in the ratio of Bcl－2／Bax．After the therapy of Xinghuayu a，b andGinkto，the number of Bax positive cells of rats hippocampal CA1 area were decreased，especially in the Xinghuayu b group（P＜0．01），whose ratio of Bcl－2／Bax was higher than the pseudosurgery group and model group（P＜0．05）．The number of Bcl－2 positive cells in rats hippocampal CA1 area of all of the group were increased（P＜0．05），especially the Xinghuayu b group（P＜0．01）．Results suggest that Xinghuayu can improve the cognitive abilities of VD rats，suggesting that there maybe relevant with the expression of Bcl－2 and Bax protein．

vascular dementia；Xinghuayu；ginkgo flavonoids；behavior；Bcl－2；Bax

R33

A

1000－1565（2012）04－0382－05

2012－03－20

河北省中醫藥管理局資助項目（2004037）；河北大學校內基金資助項目（2007Y05）

武變瑛（1958－），女，河北保定人，河北大學教授，主要從事器官缺血再灌注損傷、腦記憶功能及抗衰老的研究．E－mail：wuby9026＠126．com