應用雙球囊灌注導管局部注射紫杉醇對犬冠狀動脈支架內再狹窄的預防作用

王錦達，楊庭樹，孫志軍，郭 軍，田 峰，陳韻岱

中國人民解放軍總醫院心內科心臟介入中心，北京100853

冠狀動脈植入支架與單純球囊擴張相比，可顯著降低血管夾層、急性閉塞的發生率，但支架內再狹窄問題日益突出［1-2］。組織學研究顯示，與傳統的球囊成形術相比，支架植入更明顯地觸發了血管新生內膜的增殖，且動脈內皮細胞增殖過程顯著延長。動物實驗顯示支架金屬絲對動脈的損傷程度與新生內膜厚度、支架內狹窄程度之間顯著相關［3］。因此，支架內再狹窄的主要機制是長期過度的血管內膜、平滑肌細胞增殖和細胞外基質形成的結果［4］。藥物洗脫支架與金屬裸支架相比，可顯著降低再狹窄率，但隨著藥物洗脫支架的大量應用，逐漸出現支架部位血管瘤樣擴張、晚期血栓形成等致死性并發癥的報道［5-6］，分析其原因可能主要與支架上的多聚物涂層有關。

雙球囊灌注導管可以將紫杉醇直接灌注到靶病變部位，且紫杉醇為脂溶性藥物，具有高親脂性的特點，可以快速轉移到血管內膜，達到抑制內膜、平滑肌增殖，減輕支架內再狹窄發生的效果，并且在冠狀動脈腔內不留有任何藥物載體，避免了多聚物的不良反應。本研究旨在利用動物實驗模型，評價應用雙球囊灌注導管在冠狀動脈內局部灌注紫杉醇預防支架內再狹窄的有效性和安全性。

材料和方法

主要試劑與儀器

紫杉醇:取0.1 ml的紫杉醇溶解于34.9 ml的生理鹽水中，制備成20 μmol/L的實驗用藥。

雙球囊灌注導管:本研究使用的雙球囊灌注導管 (瑞士Acrostak公司)均為3.0 mm×20 mm，導管直徑為3F(圖1)。最遠端的灌注部分包括2個阻塞球囊和球囊中間的灌注區域，灌注時，阻塞球囊直徑達到3 mm，灌注區域直徑為2 mm;遠端球囊的內側分布有3個側孔用來灌注藥物，此灌注部分通過中心腔和末端連接口連接于壓力泵;灌注球囊的工作壓為303 kPa。

動物模型本研究在解放軍總醫院動物實驗室完成，隨機選取15只雜種犬作為實驗組，5只作為對照組。冠狀動脈損傷模型的制作方法參照Schneider等［7］的方法進行。實驗動物術前12 h喂食阿司匹林和硫酸氫氯吡格雷，靜脈全身麻醉，給予心電監護，穿刺右側股動脈植入6F動脈鞘，按照1 mg/kg的劑量動脈內注射普通肝素。調整指引導管進入左主干開口，行左冠狀動脈造影顯示前降支和回旋支，選擇直徑為2.75～3.0 mm且無直徑大于1 mm分支的冠狀動脈作為靶血管段，送入3.0～3.5 mm×8 mm的預擴張球囊到達靶血管段，以1010～1616 kPa的壓強反復擴張3～4次，每次持續15 s，每次間隔2 min。實驗組用高壓注射器抽取配制好的20 μmol/L紫杉醇溶液10 ml，并連接于雙球囊灌注導管的末端，沿冠狀動脈成形術 (percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)導絲送入雙球囊灌注導管到達預損傷的靶血管段，確定損傷血管段完全被灌注球囊的灌注部分覆蓋，維持303 kPa灌注紫杉醇溶液，對照組抽取10 ml生理鹽水對靶血管進行灌注，灌注時間為(26.45±5.18)s。最后沿導絲送入3.0 mm×8 mm的316L不銹鋼金屬裸支架 (LP-STENT，Boston Scientific)到達靶血管段，以808～1010 kPa的壓強釋放，支架膨脹良好。繼續觀察實驗動物30 min，心率、血壓無異常，送回動物飼養室觀察，每天喂食阿司匹林100 mg和硫酸氫氯吡格雷50 mg。

圖1 雙球囊灌注導管Fig 1 Double-balloon perfusion catheter

冠狀動脈造影分析支架植入3個月后首先行冠狀動脈造影復查，進行冠狀動脈造影計算機定量分析 (quantitative coronary angiography，QCA)，測量靶血管狹窄情況，觀察是否有瘤樣擴張、血栓形成或血管閉塞等并發癥。冠狀動脈造影復查靶血管直徑狹窄≥50%定義為再狹窄。

光學相干斷層成像分析冠狀動脈造影復查后行光學相干斷層成像 (optical coherence tomography，OCT)檢查，OCT成像及分析應用M2 OCT成像系統完成。應用OCT系統內的軟件進行定量分析，測量工作由2名熟練技師完成，觀察所有支架金屬絲被內膜覆蓋情況，選擇每枚支架內直徑最小處管腔測量各項指標，并測量此切面支架近端的距離，以便獲得同一切面的病理切片進行分析。

組織學分析OCT檢查結束后處死動物，快速取出心臟，用50 ml注射器抽取肝素鹽水反復沖洗左冠狀動脈直至血液完全被沖洗干凈，保證血管內無殘余血栓，用高壓注射器抽取10%福爾馬林溶液維持808 kPa灌注靶血管10 min，然后分離出靶血管段，用黑色細線標記血管近端。標本保存于10%福爾馬林溶液，最后統一行病理切片分析，常規脫水處理后用甲基丙烯酸甲酯進行固定包埋，以專用的冠狀動脈支架切片刀 (LEICA RM 2255，樂普醫療器械公司)進行切片，每張切片厚度為7 μm，采用HE染色。根據OCT記錄支架內直徑最小處距支架近端邊緣的距離，選取此位置行病理切片并在顯微鏡下測量各項指標。

OCT和組織學檢查測量指標(1)新生內膜厚度 (mm):測量支架每個金屬絲到達血管內膜的垂直距離，取其平均值。(2)殘余管腔面積 (mm2):血管腔的實際面積，邊界為血管內膜。(3)新生內膜面積 (mm2):以支架為外邊界，以內膜為內邊界，測量其間的總面積，即支架內膜增生的面積。(4)支架面積 (mm2):以支架為邊界，測定所包含的面積。(5)外彈力膜面積 (mm2):以外彈力膜為邊界，測定所包含的面積。(6)狹窄程度 (%)=新生內膜面積/支架面積 (%)。

統計學處理應用統計學軟件SPSS 11.0進行統計學處理。計量資料以均數±標準差表示，所有數據均符合正態分布，采用t檢驗;計數資料以率或百分數表示，采用卡方檢驗;以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一般情況所有實驗動物均完成本研究，雙球囊灌注導管順利完成局部藥物注射。所有動物心電圖均記錄到ST段壓低或抬高的情況，灌注結束后，ST段迅速恢復到灌注之前的形態，心率波動在140～190次/min，未出現室速、室顫等惡性心律失常。隨訪過程中，1例動物股動脈穿刺處出現血腫，未影響本研究進行。

冠狀動脈造影結果3個月后冠狀動脈造影復查發現兩組均有部分支架段的影像學異常，QCA顯示實驗組再狹窄發生率為33.33%，對照組為60%，對照組再狹窄發生率顯著高于實驗組，差異有統計學意義 (P＜0.05)。兩組的典型QCA分析圖見圖2。

OCT分析結果3個月后OCT檢查示兩組支架均完全內皮化，無血栓、局部瘤樣擴張，對照組支架內膜增生程度明顯強于實驗組 (表1，圖3)。

組織學檢查結果所有組織標本取出后均未見血管內有新鮮或者陳舊性血栓形成，行病理分析，所有標本支架內可見不同程度的內膜增生，增生成分主要以內膜增殖為主，平滑肌細胞增生及遷移不明顯。未見到血栓、瘤樣擴張或血管壁細胞壞死，其中一張切片有脂肪滴侵入，為切片過程中所致。所有切片支架均完全內皮化，支架金屬絲基本均勻分布于血管內膜下，內膜明顯增厚，血管腔變窄，部分標本內彈力纖維被支架金屬絲壓斷，部分標本內彈力纖維被擠壓變形但結構完整，兩種情況平滑肌增生基本相似，未見平滑肌細胞嚴重增生的情況。所有標本在新生內膜和平滑肌細胞中均可見到輕度的炎癥反應，炎癥細胞均勻散在分布于新生組織中，支架金屬絲周圍未出現炎癥細胞過度聚集的情況。對照組標本血管內膜增生出現不對稱、管腔狹窄較重且呈不規則狀的特點，實驗組支架內增生明顯較對照組輕 (圖4)，且增生基本均勻對稱。實驗組內膜增殖明顯弱于對照組 (表2)。

圖2 支架植入3個月后冠狀動脈造影計算機定量分析圖Fig 2 Images of quantitative coronary angiography 3 months after stent implantation

表1 支架植入3個月后冠狀動脈靶血管段OCT結果 (±s)Table 1 OCT parameters of target segment of coronary artery 3 months after stent implantation(±s)

表1 支架植入3個月后冠狀動脈靶血管段OCT結果 (±s)Table 1 OCT parameters of target segment of coronary artery 3 months after stent implantation(±s)

OCT:光學相干斷層成像;由于OCT無法穿透支架金屬絲的遮擋，不能精確測量外彈力膜面積，故表中未顯示;與對照組比較，aP＜0.05OCT:optical coherence tomography;Area of extra elastic lamina is absent because OCT could not measure it precisely;aP＜0.05 compared with control group

組別Group新生內膜厚度Neointimal thickness(mm)殘余管腔面積Lumen area(mm2)新生內膜面積Neointimal area(mm2)支架面積Stent area(mm2)狹窄程度Extent of stenosis(%)對照組Control group 0.38±0.03 2.78±0.57 2.51±0.47 5.31±0.92 47.40±4.50實驗組Treatment group 0.19±0.08a 3.50±0.66a 1.52±0.49a 5.01±0.79 30.13±8.56a

圖3 支架植入3個月后冠狀動脈靶血管段OCT分析圖Fig 3 OCT images of target segment of coronary artery 3 months after stent implantatioin

圖4 支架植入3個月后冠狀動脈靶血管段病理結果 (HE，×10)Fig 4 Pathological results of target segment of coronary artery 3 months after stent implantation(HE， ×10)

表2 支架植入3個月后冠狀動脈靶血管段組織學檢查結果(±s)Table 2 Histologic parameters of target segment of coronary artery 3 months after stent implantation(±s)

表2 支架植入3個月后冠狀動脈靶血管段組織學檢查結果(±s)Table 2 Histologic parameters of target segment of coronary artery 3 months after stent implantation(±s)

與對照組比較，aP＜0.05aP＜0.05 compared with control group

組別Group新生內膜厚度Neointimal thickness(mm)殘余管腔面積Lumen area(mm2)新生內膜面積Neointimal area(mm2)外彈力膜面積Extra elastic lamina area(mm2)支架面積Stent area(mm2)狹窄程度Extent of stenosis(%)對照組Control group 0.47±0.05 1.85±0.55 3.43±0.35 6.27±0.96 5.28±0.39 65.40± 8.23實驗組Treatment group 0.22±0.10a 3.15±0.43a 1.85±0.78a 6.88±0.33 4.99±0.81 36.00±10.97a

討 論

本研究應用雙球囊灌注導管在靶血管內局部灌注紫杉醇，Herdeg等［8］的基礎研究顯示，通過這種雙球囊灌注導管可以有效地將紫杉醇轉運到冠狀動脈血管壁中，達到抑制內膜和平滑肌增殖的有效濃度，而且其作用可以維持14 d。這種方法最大的安全隱患為阻斷血流，有可能導致嚴重心肌缺血、心律失常等并發癥，有研究表明，惡性心律失常高發于阻斷冠狀動脈血流5～20 min時。本研究中采用的灌注時間平均為 (26.45±5.18)s，并且在此時間內，紫杉醇能夠有效轉移到血管壁中發揮作用，在球囊阻斷血流的過程中盡管出現心電圖ST段變化，但是未發生惡性心律失常、死亡等嚴重并發癥，提示本研究采用的方法是安全的。

紫杉醇通過促進微管蛋白聚合，抑制解聚，保持微管蛋白穩定性，抑制細胞有絲分裂，從而抑制細胞增殖［9］。本研究就是利用了紫杉醇抑制冠狀動脈內膜及平滑肌增殖的作用。關于紫杉醇的毒副作用，目前報道的有白細胞減少、外周神經毒性等，也有無癥狀、一過性心動過緩的報道，這些都是在針對惡性腫瘤患者的大劑量化療時表現出來的，其藥物濃度為本研究的100～1000倍，而且都是長時間給藥。本研究使用的紫杉醇濃度和劑量極低，用藥后在外周血中幾乎測不到紫杉醇的濃度，所以基本不會產生毒副作用。在術后3個月的時間內，所有動物均存活，經相關檢查未發現血栓、血管正性重構、支架內皮化不全等并發癥，也說明這種方法的安全性。

目前評價支架有效性的方法包括冠狀動脈造影再狹窄率以及近年來應用的OCT評價方法，評價指標包括支架內膜覆蓋的程度和厚度等［10-11］。本研究中術后3個月時冠狀動脈造影發現對照組再狹窄率明顯高于實驗組，OCT和病理檢查也均發現對照組內膜增生厚度、面積、狹窄程度均顯著高于實驗組，結果提示應用雙球囊灌注導管局部注射紫杉醇可以顯著降低裸支架再狹窄的發生率。

本研究給藥方法的一大優點是藥物可以充分均勻地作用到整個靶血管壁，有別于藥物洗脫支架將藥物攜帶于金屬絲表面，對血管壁的藥物作用是支架的印記效應。本研究在OCT和病理分析中發現實驗組支架表面的內膜增生厚度和對照組相比，較為均一。但本研究未設置藥物洗脫支架組并與其進行對比，這是本研究的不足之處。

OCT可以在活體上精確評價支架植入后的內膜覆蓋程度和厚度，所以OCT正逐漸被用來評價支架植入安全性和有效性，本研究中應用OCT也驗證了實驗組處理方法的有效性，其測量結果與病理學方法相一致。應用OCT評價支架術后內膜增生情況是該研究的一個創新點。

總之，本研究結果顯示:應用雙球囊灌注導管在靶血管內局部灌注紫杉醇，可以安全、有效地降低裸支架內內膜增殖，獲得較大的管腔面積。

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