不同入肝血流阻斷方式對大鼠肝切除術后肝再生的影響

王鵬飛，李崇輝，張愛群，蔡守旺，董家鴻

中國人民解放軍總醫院肝膽外科 全軍肝膽外科研究所，北京100853

肝臟是全身唯一的有兩套供血系統的器官，其中門靜脈供血占70%～80%，肝動脈占20%～30%，正常情況下肝竇內血供主要來源于門靜脈，當門靜脈阻斷時，靜脈竇內血流顯著降低甚至難以測到，而阻斷肝動脈時，肝血竇內仍保留80%的血流［1］。目前大多外科醫生進行肝臟手術時為減少離斷肝實質時的出血量，采用肝蒂三聯阻斷 (occlusion of portal triad，OPT)法 (即Pringle法)，但該法不可避免會對剩余肝臟造成缺血再灌注損傷，從而影響患者的愈后［2］。同時，筆者臨床觀察發現，采用保留肝動脈的入肝血流阻斷方法同樣能達到較好的止血效果。本研究組之前的動物研究也證實該方法可以大大減輕肝臟缺血再灌注損傷［3］。但是該方法與傳統Pringle手法對肝再生的影響鮮有報道。本實驗以不阻斷入肝血流單純切除大鼠68%肝臟為對照組，對比研究傳統的OPT法與保留肝動脈單純門靜脈阻斷(occlusion of portal vein，OPV)法對大鼠肝切除術后肝再生的影響。

材料和方法

實驗動物健康雄性Wistar大鼠，體重240～260 g，由軍事醫學科學院實驗動物中心提供。自由飲水，隨意進食，12 h照明，適應環境1周后開始實驗。

動物模型的建立

實驗動物分組:采用經尾狀葉轉流門靜脈血流阻斷模型，按Higgins法切除大鼠68%肝臟，根據阻斷方式將健康雄性Wistar大鼠隨機分為3組:對照組、OPT組和OPV組。

手術操作:術前12 h禁食，不禁水。用10%水合氯醛按3 ml/kg劑量腹腔內注射麻醉。仰臥位固定后碘伏消毒，取上腹正中切口約1.5～2.0 cm入腹，充分顯露肝區結構，離斷肝周韌帶，以顯微外科方法分離出擬阻斷血管。OPT組:為避免腸道淤血干擾研究結果，選擇經尾狀葉轉流門靜脈血流阻斷模型［4］:用小號動脈夾分別阻斷肝左、右葉肝蒂 (約占全肝95%)，造成受累肝葉缺血，保留尾狀葉(約占全肝5%)血供，作為門靜脈血液經肝臟回流入下腔靜脈的通道。OPV組:兩個血管夾分別只阻斷肝左葉、右葉肝蒂內門靜脈，達到預定阻斷時間后去除阻斷夾。OPT組和OPV組達到預定阻斷時限后按照Higgins法切除68%肝臟，對照組不阻斷血流，僅切除68%肝臟，保證每只大鼠總的手術時間均為60 min。生理鹽水灌洗切除肝臟后稱取肝臟濕重W1，分層連續縫合關腹。術中腹腔補充5 ml溫熱生理鹽水，術后電熱毯保溫到蘇醒，自由進食水。

標本收集及處理觀察3 d、7 d兩個時相點，每個時相點保證至少8只大鼠存活。

肝組織放射性活度:每只大鼠二次開腹后于下腔靜脈注射0.3 ml藥盒法標記的99Tcm-GSA，放射量約37 MBq(高锝酸鈉注射液購自原子高科有限公司，GSA購自北京師宏藥物研制中心)。注射后15 min斷頭處死，取出肝臟，生理鹽水灌洗后稱得重量W2，并在放射性活度計 (CRC-25R，美國CAPINTEC INC.)內測量其放射性計數N，放射性活度=N/W2［5］。用10%福爾馬林溶液固定標本，石蠟包埋，切片后免疫組織化學檢測。

肝再生度:每只大鼠術后均稱取肝臟濕重W1，根據切除肝臟占整體肝臟68%，算得大鼠原肝臟重量W0=W1/0.68，二次手術時切取全部肝臟后稱重W2，肝再生度=(W2-W0×0.32)/W0×100%。

增殖細胞核抗原 (proliferating cell nuclear antigen，PCNA)標記指數:石蠟切片按照說明書以PCNA單抗 (DAKO公司)進行免疫組化染色，以聯苯二氧胺顯色，甲基綠復染。本實驗的陽性染色信號呈棕黃色。PCNA標記指數以每例在光鏡下隨機挑選5個高倍視野 (×400)中至少1000個細胞，計數的PCNA陽性核的百分數來表示 (陽性細胞數目/計數的肝細胞總數×100%)。

Ki-67標記指數:石蠟切片按照說明書以Ki-67單抗 (abcam公司)進行免疫組化染色，以聯苯二氧胺顯色，甲基綠復染。本實驗的陽性染色信號呈棕黃色。Ki-67標記指數以每例在光鏡下隨機挑選5個高倍視野 (×400)中至少1000個細胞，計數的Ki-67陽性核的百分數來表示 (陽性細胞數目/計數的肝細胞總數×100%)。

統計學處理實驗數據以均數±標準差表示。采用SPSS 13.0統計軟件進行SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

安全阻斷時限Higgins法切除大鼠肝臟之前，各組入肝血流阻斷時間分別為20、30、40 min時，OPT組術后7 d的存活情況為5/5、3/5、0/5，OPV組術后7 d的存活情況為5/5、4/5、3/5。阻斷40 min后行肝切除術，術后1周內OPV組生存率明顯高于OPT組。考慮到大鼠生存率，將后續實驗的阻斷時限設定為30 min。

肝再生度各組大鼠肝切除術后肝再生度結果顯示:3 d和7 d兩個時相點，OPV組術后肝再生度與對照組接近，兩組均高于OPT組，但差異無統計學意義 (P＞0.05)(表1)。

放射性活度各組大鼠術后3 d及7 d放射性活度結果顯示:術后第3天，對照組和OPV組的肝組織放射性活度均大于OPT組，差異具有統計學意義(P均＜0.05);術后第7天，各組之間放射性活度差異無統計學意義 (P＞0.05)(表1)。

肝細胞PCNA標記指數各組大鼠術后3 d及7 d PCNA標記指數結果顯示:術后第3天，對照組和OPV組的PCNA標記指數均大于OPT組，差異具有統計學意義 (P均＜0.01);而對照組和OPV組之間差異無統計學意義 (P＞0.05)。術后第7天，對照組、OPV組和OPT組之間的PCNA標記指數差異無統計學意義 (P＞0.05)(表1)。免疫組化染色結果見圖1。

再生肝臟Ki-67標記指數各組大鼠肝切除術后3 d及7 d Ki-67標記指數結果顯示:術后第3天，對照組Ki-67標記指數大于OPT組，差異具有統計學意義 (P＜0.01);OPV組Ki-67標記指數亦大于OPT組，差異具有統計學意義 (P＜0.05);且對照組和OPV組之間差異無統計學意義 (P＞0.05)。術后第7天，對照組、OPV組和OPT組之間的Ki-67標記指數差異無統計學意義 (P＞0.05)(表1)。免疫組化染色結果見圖2。

圖1 各組大鼠術后剩余再生肝臟PCNA免疫組化染色結果 (×400)Fig 1 Immunohistochemistry of residual liver for PCNA in each group after hepatectomy(×400)

表1 各組大鼠肝切除術后肝再生度、再生肝臟的放射性活度、PCNA標記指數和Ki-67標記指數 (±s)Table 1 Liver regeneration rate，radioactivity，and PCNA and Ki-67 labeling index in each group following hepatectomy(±s)

表1 各組大鼠肝切除術后肝再生度、再生肝臟的放射性活度、PCNA標記指數和Ki-67標記指數 (±s)Table 1 Liver regeneration rate，radioactivity，and PCNA and Ki-67 labeling index in each group following hepatectomy(±s)

與 OPT組比較，aP＜0.05，bP＜0.01aP ＜0.05，bP ＜0.01 compared with OPT group

肝再生度Liver regeneration rate(%)放射性活度Radioactivity(MBq/g)PCNA標記指數Ki-67標記指數組別Group 術后7 d 7 days after術后7 d 7 days after術后7 d 7 days after術后7 d 7 days after術后3 d 3 days after hepatectomy hepatectomy術后3 d 3 days after hepatectomy hepatectomy對照組Gontrol group 46.4± 7.4 77.0±14.9 0.949±0.090a 1.070±0.067 62.4±6.7b 14.6±3.5 45.5±7.4b 6.8±2.7 OPT組OPT group 40.0± 6.9 65.8±14.2 0.719±0.087 0.985±0.061 52.3±3.9 14.2±2.9 32.5±9.7 5.5±2.8 OPV組OPV group 47.1±10.5 73.0±13.5 0.855±0.056a 1.005±0.088 59.4±4.6b 13.2±3.0 41.6±8.6a hepatectomy PCNA labeling index術后3 d 3 days after hepatectomy hepatectomy Ki-67 labeling index術后3 d 3 days after hepatectomy 6.5±3.8

圖2 各組大鼠術后剩余再生肝臟Ki-67免疫組化染色結果 (×400)Fig 2 Immunohistochemistry of residual liver for Ki-67 in each group after hepatectomy(×400)

討 論

肝臟是一個血供豐富的內臟器官，肝切除過程中肝創面出血是影響手術及術后患者恢復的重要因素［6］。自1908年Pringle提出通過阻斷肝蒂的入肝血流來減少肝臟手術出血的方法后，研究者們又提出多種改良方法，很大程度上提高了肝臟手術的安全性，促進了復雜肝臟手術的開展。然而，這些阻斷方法不可避免會對剩余肝臟造成缺血再灌注損傷［2］。正常情況下，肝動脈提供肝臟50%以上的供氧量，有研究表明肝動脈有較高的壓力梯度，能充分灌流肝臟血管網絡的每一個角落，門靜脈阻斷時盡管入肝血流量大大降低，但是通過測定組織氧分壓，發現肝動脈依然可以滿足肝組織代謝所需氧分［7］。筆者通過臨床觀察發現，手術中保留肝動脈單純阻斷門靜脈同樣能達到較好的止血效果，并且可以一定程度上延長連續阻斷時間，避免了Pringle手法反復阻斷開放而增加的手術時間和開放等候時增加的無益出血量，且術后患者恢復良好，未出現嚴重并發癥。本研究所前期的動物研究采用相同的分組方法，比較了血生化指標谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶，氧化應激指標丙二醛、過氧化物歧化酶，細胞能量代謝指標Na-K-ATP酶以及HE染色病理切片，結果顯示保留肝動脈的入肝血流阻斷方法緩解了由于阻斷肝門血流而引起的肝細胞能量匱乏，可穩定細胞結構，減少細胞損傷，大大減少了剩余肝臟的缺血再灌注損傷［3］。肝臟再生能力是肝部分切除術后肝功能恢復的關鍵因素，本研究的著眼點即對比不同入肝血流阻斷方式對肝再生的影響。

評價肝再生的方法有很多，肝再生度表示再生肝重占原肝重的百分率，在一定程度上能較好地反映再生肝臟的增長情況，是一種較直觀、簡單的方法［8］。此外免疫組織化學方法具有簡單、迅速，且能保持組織結構完整性等優點而受到廣泛重視，本實驗采用了國內外研究通用的PCNA和Ki-67兩個肝再生指標，PCNA在細胞周期的S期高峰表達，Ki-67則在M期高峰表達，同時觀察上述兩項指標，可以較客觀地反映肝再生情況［9-10］。從本實驗的結果可知，雖然各組在術后3 d、7 d兩時相點上肝再生度差異無統計學意義，但是在術后第3天，OPV組PCNA標記指數和Ki-67標記指數顯著高于OPT組，且與單純切肝對照組差異均無統計學意義。說明在保留肝動脈的入肝血流阻斷方法下行肝切除術后，雖然在重量和體積方面還沒有體現出相對于完全阻斷組的明顯優勢，但早期 (3 d)核蛋白表達明顯增強，提示殘肝肝細胞增殖活躍，更有利于術后肝再生及早期恢復。

正如臨床上經常碰到的問題一樣，肝臟的體積大小并不總能代表肝臟功能的好壞，功能性肝再生也不完全同步于體積性肝再生［11］。近些年來，99Tcm-GSA越來越多地被用于評估肝臟功能的動物實驗及臨床工作。其機制是GSA可以與僅在哺乳動物的肝細胞表面表達的去唾液酸糖蛋白受體特異性結合［12］。日本及國內的多個研究表明，在肝炎、肝硬化或肝癌等肝損傷性疾病發生時，哺乳動物肝細胞膜上的去唾液酸糖蛋白受體數量和活性均受到損害，肝臟組織的放射性活度均降低［5，13］。本研究結果顯示術后第3天，OPV組肝臟的放射性活度明顯高于OPT組，與對照組差異無統計學意義，表明OPV組肝臟細胞表面去唾液酸糖蛋白受體數量更多，即功能性肝體積要優于OPT組。這提示在肝切除手術中，采用保留肝動脈血供的入肝血流阻斷方法在減少缺血再灌注損傷的同時更有利于剩余肝臟早期再生，相比臨床常用的Pringle法有較大的優勢。

總之，保留肝動脈入肝血流阻斷法肝切除組相比完全入肝血流阻斷組，術后早期雖然肝臟再生度差異無統計學意義，但是再生核蛋白表達顯著增加，功能性肝體積亦顯著增大，且與不阻斷對照組差異無統計學意義，提示保留肝動脈減輕缺血再灌注損傷的同時也有利于術后早期剩余肝臟再生。這或許提示在臨床工作中，保留肝動脈血供的入肝血流阻斷法是一個值得推廣的更好的肝血流阻斷方法。

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