CD34+CD38－Lin－細胞群單個細胞培養的初步研究

韓有金，齊軍元，邱錄貴

中國醫學科學院 北京協和醫學院 血液學研究所 血液病醫院實驗血液學國家重點實驗室，天津300020

干細胞是近年來醫學生物學領域內的研究熱點之一，其中很大一部分研究成果集中在造血干細胞。干細胞的重要特性是具有自我更新能力、較強的增殖能力以及多向分化潛能［1］。這些生物學特性的維持和生物學行為的發生依賴于一些關鍵的信號通路，如 Hedgehog［2］、BMP［3］、Notch［4］通路。這些信號通路中的關鍵信號分子在造血干細胞中的作用一直是研究人員關注的重點。本研究在單個CD34+CD38-Lin-細胞水平上分別就上述通路的一些關鍵信號分子如Shh、BMP-4、Jagged-1對于CD34+CD38-Lin-細胞群體的自我更新、增殖擴增、定向分化的影響進行研究。

材料和方法

材料與試劑足月健康新生兒臍帶血6份，每份100 ml，經產婦及家屬書面同意用于本研究。淋巴細胞分離液，密度1.073 g/ml;Lin-磁珠分離試劑盒、Mini MACS分離器、LS和MS分離柱 (德國Miltenyi Biotec公司)，7-氨基放線菌素D(7-aminoactinomycin D，7-AAD)細胞凋亡染色試劑盒 (以色列FERMENTEK公司)，鼠抗人CD34和CD38，流式細胞儀 (美國BD公司)，干細胞培養基、人造血干細胞甲基纖維素培養基MethoCult H4434(StemCell公司)。

CD34+CD38－Lin－細胞分選取足月健康新生兒臍帶血，分離出其中的干細胞即CD34+CD38-Lin-細胞，具體步驟簡述如下:經Fincoll分離得到單個核細胞，然后經免疫磁珠法先分離出其中的Lin-細胞群，再分離出上一步中所得細胞的CD34+細胞群，最終得到CD34+CD38-Lin-細胞群。用流式細胞術分析所得細胞的存活率及細胞純度。

單個CD34+CD38－Lin－細胞生存能力檢測取分離后的CD34+CD38-Lin-細胞，用流式細胞儀將其以單個形式加入到事先加好干細胞培養基的96孔板中。按照加入細胞因子的不同，以Shh、BMP-4、Jagged-1作為實驗組，未添加細胞因子的以等量PBS作為對照組。1周內在倒置熒光顯微鏡下觀察各組細胞的存活及增殖情況。

單個CD34+CD38－Lin－細胞增殖能力檢測取分離后的CD34+CD38-Lin-細胞，用流式細胞儀將其以單個形式加入到事先加好干細胞培養基的96孔板中。按照加入細胞因子的不同，以BMP-4、Jagged-1作為實驗組，未添加細胞因子的以等量PBS作為對照組。1周后計數各組細胞的每孔細胞數。

單個CD34+CD38－Lin－細胞集落形成分析用流式細胞儀將分離后的CD34+CD38-Lin-細胞以單個形式加入到事先加好甲基纖維素培養基的96孔板中。按照加入細胞因子的不同，以BMP-4、Jagged-1作為實驗組，未添加細胞因子的以等量PBS作為對照組。1周后觀察計數各組細胞形成紅系爆式集落形成單位 (erythroid colony-forming unit，BFU-E)、粒系集落形成單位 (granulocyte colony-forming unit，CFU-G)、單核細胞系集落形成單位 (macrophage colony-forming unit，CFU-M)、粒單系集落形成單位(granulocyte macrophage colony-forming unit，CFU-GM)等各式集落的情況。

統計學處理單個臍血CD34+CD38-Lin-液體培養7 d后，計數有活細胞的培養孔數，并計算有活細胞培養孔中的活細胞平均數。

結 果

CD34+CD38－Lin－細胞群的分離用7-AAD陰性和側向角 (side scatter，SSC)兩個參數設門，以免流式細胞儀分選到死亡細胞 (圖1A);再用流式細胞儀分選CD34+CD38-Lin-細胞 (圖1B)。

培養1周內單個CD34+CD38－Lin－細胞的生存及倍增在培養第3天，各組均能看到單個CD34+CD38-Lin-細胞的分裂倍增現象;而在第7天能看到細胞進一步增殖 (圖2)。培養7 d后，計數每份臍帶血來源CD34+CD38-Lin-對照組和實驗組有活細胞的培養孔，計算有活細胞孔占第0天接種了細胞的培養孔的比率。第2份臍血來源CD34+CD38-Lin-細胞培養結束后，發現Shh組有活細胞孔比率雖然高于對照組，但低于BMP-4和Jagged-1組 (圖3)，故在后4份臍帶血來源CD34+CD38-Lin-細胞的培養中去掉了Shh組。

培養1周后干細胞的增殖培養1周后，計數各組每孔細胞數，并計算各組平均每孔的細胞數，對照組為5.465個細胞/孔，BMP-4組為6.295個細胞/孔，Jagged-1組為6.784個細胞/孔。每孔細胞數量的柱形分布圖顯示實驗組中每孔細胞數量為0的孔數明顯低于對照組，尤其是Jagged-1組，而實驗組每孔細胞數量多于17的孔數高于對照組，其中BMP-4組最高 (圖4)。

圖1 流式細胞儀分選CD34+CD38-Lin-細胞群的設門過程Fig 1 Gating of viable CD34+CD38-Lin-cells

圖2 培養1周內單個CD34+CD38-Lin-細胞的生存及增殖情況Fig 2 Single CD34+CD38-Lin-cell viability and proliferation from one culture well

圖3 培養1周后各組細胞的存活率Fig 3 Survival rates of wells with vital cells for each sample of umbilical cord blood after one-week liquid culture

圖4 培養1周后具有一定數量活細胞孔占有活細胞孔比率的柱形分布圖Fig 4 Percentage distribution of wells with certain number of viable cells out of total wells with viable cells

細胞集落形成經集落形成培養1周后，發現各組細胞均能形成包括 BFU-E、CFU-G、CFU-M、CFU-GM的各式集落 (圖5)。但是每孔細胞均只能形成一種集落。實驗組的每孔集落數明顯高于對照組，實驗組之間的差異并不明顯 (圖6)。

圖5 培養1周后CD34+CD38-Lin-細胞形成的各式集落Fig 5 Colonies formed by cell(s)after liquid culture of 1 week from single CD34+CD38-Lin-cell initially seeded

圖6 CD34+CD38-Lin-細胞液體培養1周后形成的集落數Fig 6 Total number of colonies formed by CD34+CD38-Lincells after 1-week liquid culture

討 論

通常認為，干細胞的命運的主要是由干細胞龕或說是其所處的微環境決定的，這個微環境主要包括一些周圍基質細胞和干細胞本身所分泌的細胞因子和生長因子等［5］。早在 1978 年，Schofield［6］就發現脾臟來源的造血細胞的增殖能力比骨髓中的造血干細胞顯著下降，因而提出了干細胞龕理論，認為干細胞的干細胞性，即自我更新能力和定向分化能力依賴于干細胞龕，干細胞龕能精確調節真正干細胞和定向祖細胞的平衡。其后不斷有研究人員通過實驗證實該理論［7-10］。干細胞的自我更新、增殖擴增以及定向分化需要微環境的調節［11-12］，并且與多種細胞信號通路有關［13］。但最近有研究表明干細胞在不依賴微環境的單細胞狀態下也能向多系分化［14］，說明其內部因素也發揮了非常重要的作用。

為了探討造血干細胞的自我更新、增殖與分化在多大程度上依賴于體內的微環境，或者細胞本身的遺傳因素是否更為重要，本研究分離培養新生兒臍帶血中被證明含有造血干細胞的CD34+CD38-Lin-細胞群體［15］，通過在不同條件的培養體系中進行單細胞水平的培養和集落形成實驗，來研究造血干細胞的生物學特性。

本研究從新生兒臍帶血中成功分離出CD34+CD38-Lin-細胞群，流式細胞術檢測表明其活性很好，純度也比較高，保證了進行下一步實驗的可靠性。

隨后利用流式細胞儀將所分離的CD34+CD38-Lin-細胞進行培養，且每天觀察其生長情況，結果發現在培養的第3天，不管是空白對照組還是分別加入了相同濃度的細胞因子Shh組、BMP-4組和Jagged-1組，都出現了細胞的分裂增殖現象。而培養1周后計數，細胞進一步增殖變多，實驗組細胞數量普遍明顯多于對照組，說明含有造血干細胞的CD34+CD38-Lin-細胞群的增殖并不完全取決于外部微環境，細胞內部的遺傳因素在其中起決定性作用;而實驗組的細胞數量普遍較多，說明微環境尤其是細胞信號通路分子確實對于CD34+CD38-Lin-細胞(含有造血干細胞)的生存及自我更新有重要作用。

接下來的單細胞水平的集落形成實驗則是為了研究CD34+CD38-Lin-細胞的分化能力與微環境及其自身內部遺傳因素的關系。經集落形成培養1周后，本研究發現各組細胞都能形成包括BFU-E、CFU-G、CFU-M、CFU-GM在內的各式集落，但每孔細胞均只能夠形成一種集落。這個結果可能由兩方面的原因所導致:一方面可能是分離得到的CD34+CD38-Lin-細胞群中沒有具有干細胞性的造血干細胞，而僅僅包含已經定向的祖細胞;另一方面可能是造血干細胞在單細胞水平下分裂增殖時喪失了干細胞性，所得到的子代細胞均為定向祖細胞，只具有單能性，不具有全能性。而要保持干細胞的生物學特性，則必須由外部信號分子和細胞內部分子相互作用，需要干細胞與外部微環境進行交流，從而調控干細胞的自我更新和增殖分化的平衡。這種可能性最近被 Sarrazin 等［16］和 Rieger等［17］的研究所證實。

總之，造血干細胞的生物學特性與微環境關系非常密切;其內部的遺傳機制對造血干細胞的存活與增殖起決定性作用，外部因素起到促進作用，微環境中的細胞因子尤其是信號分子能極大提高干細胞的存活和增殖能力，干細胞生物學特性的保持尤其是全能性的保持嚴重依賴于與外界微環境的信息交流。本研究結果對白血病的治療有一定的啟示作用，白血病干細胞有可能依賴于微環境實現自我更新而保持干細胞性，因此治療應針對其存活的微環境，從切斷其與微環境的信息交流入手。

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