米曲霉(Aspergillus oryzae)滬釀3.042內切型纖維素酶的分離純化與鑒定

武金霞，常淑英，孫鵬，張永闊，張賀迎

(1.河北大學 生命科學學院,河北 保定 071002；2.河北大學 生物技術研究中心,河北 保定 071002)

米曲霉(Aspergillus oryzae)滬釀3.042內切型纖維素酶的分離純化與鑒定

武金霞1，常淑英1，孫鵬1，張永闊1，張賀迎2

(1.河北大學 生命科學學院,河北 保定 071002；2.河北大學 生物技術研究中心,河北 保定 071002)

為了解米曲霉纖維素酶在物料分解過程中的作用，從米曲霉滬釀3.042成曲中提取粗酶液，利用DNS法分析了粗酶液中外切酶、內切酶及β-葡萄糖苷酶的活力.用剛果紅染色法確定了滬釀3.042成曲粗酶液中含有4種內切型纖維素酶，分別稱為Cx酶Ⅰ，Cx酶Ⅱ，Cx酶Ⅲ 和Cx酶Ⅳ.經DEAE-Cellulose-52離子交換層析，0.15,0.20,0.25，0.30 mol/L NaCl洗脫峰均測得內切型纖維素酶活性，制備電泳純化得到4個內切型纖維素酶組分，SDS-PAGE結果顯示，Cx酶Ⅰ，Cx酶Ⅱ，Cx酶Ⅲ為單體酶，分子質量分別為31 800，34 000，26 000 u，Cx酶Ⅳ含有4個亞基，分子質量分別為14 000，23 600，26 000,33 500 u.粗酶液中內切型纖維素酶的最適反應溫度為50 ℃,最適反應pH值為4.0.

米曲霉；內切型纖維素酶；剛果紅染色；離子交換層析；制備電泳

米曲霉是一種絲狀真菌，因其生長過程中能夠產生豐富的水解酶系，被廣泛應用于食品、飼料、釀酒等行業[1].米曲霉滬釀3.042是應用于國內醬油釀造行業的主要菌株之一，其生長環境粗放，適應性強，生產纖維素酶產量高，穩定性好，而且其產生的纖維素酶是胞外酶，發酵完成后，纖維素酶容易與菌體分離純化得到所需的酶.纖維素酶(cellulase)是分解纖維素的一類酶, 包括內切葡聚糖酶(endo-1,4-β-D-glucanase EC 3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(exo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-1,4-glucosidase，EC3.2.1.21)[2-3]，這些酶組分協同作用將纖維素分解為葡萄糖.在釀造過程中纖維素酶可以分解物料細胞壁,增加細胞內含物的溶出，有利于蛋白酶充分作用于大豆蛋白，從而提高原料的利用率和氨基酸態氮生成率[4].有報道醬油生產中添加纖維素酶或提高菌株的纖維素酶活力，有利于提高醬油質量和出油率[5].本實驗室曾初步以剛果紅染色法檢測出米曲霉3.042含有2種內切型纖維素酶組分[6]，本研究擬進一步鑒定并純化米曲霉滬釀3.042菌株的內切型纖維素酶組分，研究其酶學性質，為進一步了解纖維素酶在釀造過程中的具體作用，以及與其他酶的協同機制提供理論基礎.

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 菌種

米曲霉(Aspergillusoryzae)滬釀3.042(本實驗室保藏).

1.1.2 培養基

m(豆粕)∶m(麩皮)∶m(水)=6∶4∶10.

1.1.3 主要實驗儀器

HWS型智能恒溫恒濕箱(寧波東南儀器有限公司)，SH-5磁力攪拌器(BeiDe)，GL 20A高速冷凍離心機(中國湘西儀器廠)，數顯恒溫水浴鍋(金壇市醫療儀器廠)，BG-Power 600電泳儀(BAYGENE)， 721型分光光度計(上海第三分析儀器廠).

1.2方法

1.2.1 米曲霉纖維素酶粗酶液的制備

稱取5 g成曲，充分研磨后加20 mL 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.2)，磁力攪拌15 min，4 ℃ ，10 000 r/min離心15 min，上清液即為粗酶液，分裝后放置于-20 ℃冰箱備用.

1.2.2 葡萄糖標準曲線制作

采用DNS法[7]制作葡萄糖標準曲線.

1.2.3 粗酶液纖維素酶的酶活測定

1.2.3.1 內切型纖維素酶活力測定

將粗酶液稀釋10倍，取3支刻度試管，分別加入0.1 mL稀釋酶液，再分別吸取1.9 mL 10 g/L的羧甲基纖維素鈉(CMC)(pH 5.0，0.05 mol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液配制)溶液，50 ℃水浴保溫30 min；空白樣用煮沸滅活的稀釋酶液 0.1 mL代替樣品，同樣50 ℃水浴保溫30 min.再吸取DNS試劑2 mL，充分搖勻后具塞，沸水浴反應10 min,冷卻至室溫后用去離子水定容至15 mL，上下搖勻，用空白調零點，于550 nm 下測定OD值.根據標準曲線求出對應葡萄糖產量，計算出粗酶液中內切型纖維素酶活力(U/mL).每小時由底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量定義為1個酶活力單位(U).計算公式：

A:OD值在標準曲線上對應的葡萄糖量(mg)；D:酶液的稀釋倍數；t:反應時間(min).

1.2.3.2 外切型纖維素酶活力測定

采用DNS法，以脫脂棉為底物[8].

1.2.3.3β-葡萄糖苷酶活力測定

采用DNS法，以水楊素為底物[9].

1.2.4 蛋白質含量測定

采用Folin-酚法[10]測定蛋白質含量，以標準酪蛋白溶液做標準曲線.

1.2.5 PAGE檢測粗酶液中蛋白質組成

濃縮膠質量濃度為45 g/L，分離膠質量濃度為100 g/L，濃縮膠電壓120 V，分離膠電壓150 V，室溫電泳結束后考馬斯亮藍染色15 min，用體積分數為7.0%的冰乙酸脫色至條帶清晰.

1.2.6 CMC-PAGE檢測粗酶液中內切型纖維素酶組分

參照文獻[6]稍做改進.配制質量濃度為100 g/L的PAGE分離膠，加入1 g/L CMC溶液(pH 5.0 Na2HPO4-檸檬酸緩沖液配制)0.4 mL，再配制質量濃度為45 g/L的濃縮膠，用不同濃度粗酶液點樣，濃縮膠120 V，分離膠150 V，4 ℃低溫電泳.電泳結束后，將膠切成2部分，一部分考馬斯亮藍染色，另一部分置于50 ℃預熱的0.1 g/L剛果紅染色液(用0.05 mol/L pH 5.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液配制)中，50 ℃恒溫水浴3 h后移至1 mol/L NaCl脫色液中，常溫脫色至條帶清晰.

1.2.7 DEAE-Cellulose-52離子交換層析初步分離內切型纖維素酶

將DEAE-Cellulose-52離子交換柱用pH 7.2，0.01 mol/L Tris-HCl緩沖液充分平衡后，取10 mL粗酶液上樣，然后以NaCl濃度依次為0.10，0.15，0.20，0.25，0.30,0.35,0.40，0.60 mol/L的pH 7.2，0.01 mol/L Tris-HCl緩沖液進行分步洗脫(3.5 mL/min).收集各洗脫峰，將各洗脫峰透析、濃縮后以天然-PAGE電泳檢測蛋白組分[11].

1.2.8 制備電泳分離純化內切型纖維素酶組分

參照剛果紅染色圖譜切膠，95 W,30 V,25 mA進行回收電泳[12].將所得的酶組分進行酶活力和分子質量測定.酶活力測定過程中，將回收的純酶凍干濃縮成酶粉后加入100 μL蒸餾水溶解，作為稀釋酶液，空白樣加入蒸餾水，其余操作同1.2.3.1.

1.2.9 粗酶液中內切型纖維素酶最適反應溫度和最適反應pH值的測定

配制含有10 g/L CMC的0.05 mol/L，pH 5.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，測定20～80 ℃內切型纖維素酶的最適反應溫度；配制含有10 g/L CMC的0.05 mol/L，pH 3.0～8.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，測定50 ℃時內切型纖維素酶的最適反應pH值[8].

2 結果

2.1米曲霉3.042纖維素酶分泌曲線

圖1顯示，制曲時間為35 h時內切型纖維素酶酶活最高，此時粗酶液蛋白質質量濃度為19.26 mg/mL,纖維素酶系中不同酶組分的酶活力如表1.

圖1 米曲霉內切型纖維素酶分泌曲線

表1 米曲霉粗酶液纖維素酶系中不同酶組分的酶活力

2.2剛果紅染色法鑒定內切型纖維素酶組分

配制PAGE分離膠時加入內切型纖維素酶的底物CMC，使其均勻分布在膠內，電泳結束后經過水浴，如果樣品液中含有內切型纖維素酶則會將CMC長鏈的纖維素分子降解為纖維寡糖, 剛果紅能將長鏈的纖維素分子染成紅色,卻不能將纖維寡糖染色，因此水浴后的凝膠經剛果紅染色后未著色的透明區域即為內切型纖維素酶的位置.由圖2 a和圖2 b可知，分離膠內添加一定質量的CMC，會造成各個蛋白條帶的相對遷移率都減小，但各個條帶的相對位置不變.由圖2 c 可知，米曲霉滬釀3.042成曲浸提液含有4個內切型纖維素酶組分，分別稱為Cx酶Ⅰ，Cx酶Ⅱ，Cx酶Ⅲ 和Cx酶Ⅳ，從透明區帶的范圍初步認為Cx酶Ⅱ，Cx酶Ⅲ具有較高的活力，而Cx酶Ⅰ和Cx酶Ⅳ活力較低.

a.天然-PAGE；b.膠內加纖維素(考馬斯亮藍染色)；c.膠內加纖維素(剛果紅染色).

2.3 DEAE-Cellulose-52離子交換層析

用DEAE-Cellulose-52離子交換層析初步分離米曲霉粗酶液，280 nm下核酸蛋白檢測儀測得不同NaCl濃度的pH 7.2，0.01 mol/L的 Tris-HCl緩沖液各洗脫下一個蛋白峰(圖 3).

P1-P8分別是含0.10,0.15,0.20，0.25,0.30,0.35,0.40,0.60 mol/L NaCl的緩沖液洗脫下來的蛋白峰.

經DNS法測定酶活和天然-PAGE電泳檢測可知，0.15，0.20，0.25和0.30 mol/L NaCl洗脫下的蛋白峰含有內切型纖維素酶組分(圖4 ).其中0.15 mol/L NaCl的洗脫峰含有Cx酶Ⅲ，雖然雜蛋白較多，但遷移率與Cx酶Ⅲ相差較大.0.2 mol/L NaCl濃度下的洗脫峰含有Cx酶Ⅰ，但雜蛋白含量較多.0.25 mol/L NaCl洗脫峰含有Cx酶Ⅰ，Cx酶Ⅱ，Cx酶Ⅳ3個目標組分，且雜蛋白較少.0.3 mol/L NaCl洗脫峰含有Cx酶Ⅳ，雜蛋白也相對較少.

米曲霉粗酶液中蛋白質組分較多，由于一些蛋白質的荷電性質及分子質量相近，導致多條目標條帶和其他雜蛋白混雜在一起，僅采用離子交換層析不能有效地將單個纖維素酶組分純化.因此分別將上述不同NaCl濃度洗脫液凍干濃縮，以制備電泳切膠回收4個內切型纖維素酶組分.

1.粗酶液；2-9.0.10,0.15,0.20,0.25,0,30，0.35,0.40，0.60 mol/L NaCl洗脫峰.

2.4制備電泳分離純化內切型纖維素酶組分及分子質量測定

圖5 a和圖5 b顯示制備電泳純化的Cx酶Ⅰ，Cx酶Ⅱ，Cx酶Ⅲ 和Cx酶Ⅳ4個組分，DNS法測定其酶活分別為61.77，6.11，44.93，72.03 U/mL，因此可以確定純化到的酶組分為目標組分，后經SDS-PAGE 電泳測得Cx酶Ⅰ，Cx酶Ⅱ，Cx酶Ⅲ的分子質量分別是31 800，34 000 u(圖5 c)和26 000 u(圖5 d)；Cx酶Ⅳ含有4個亞基，分子質量分別為14 000，23 600，26 000，33 500 u(圖5 d).

2.5粗酶液中內切型纖維素酶的最適反應溫度和最適反應pH值

米曲霉(A.oryzae)滬釀3.042成曲粗酶液中內切型纖維素酶的最適反應溫度為50 ℃(圖6)，最適反應pH值為4.0(圖 7).

3 討論

米曲霉固體發酵產纖維素酶的最佳收獲期是35 h,其纖維素酶系中包含有外切型和內切型纖維素酶以及β-葡萄糖苷酶.經離子交換層析、制備電泳純化到4個內切型纖維素酶組分.SDS-PAGE結果表明，Cx酶Ⅰ，Cx酶Ⅱ，Cx酶Ⅲ為單體酶，Cx酶Ⅳ為多亞基酶，這種現象可能與不同種類內切纖維素酶的分子組成有關：纖維素酶的各組分大多是糖蛋白，含糖的比例各不相同；糖和蛋白質之間的結合方式也不同，有的是通過共價鍵連接，有的是可解離的復合物[13-14].

在醬醅發酵中，纖維素酶能起到崩潰豆餅、小麥、麩皮中的纖維素及將其分解成糖的作用，我國醬油釀造中多采用低鹽固態發酵工藝，發酵溫度較高(一般控制在40～45 ℃)，醬醅pH值較低，米曲霉產纖維素酶的最適溫度和pH值分別為50 ℃和4.0，這一特性與醬醅發酵條件一致.因此，在醬油制備過程中米曲霉纖維素酶能發揮其最大作用，提高物料的利用率.

a．天然-PAGE ：1.粗酶；2.Cx酶Ⅱ；3.Cx酶Ⅰ.b.天然-PAGE : 1.粗酶；2.Cx酶Ⅲ；3.Cx酶Ⅳ.c.SDS-PAGE：1.粗酶；2.低分子質量標準蛋白；3.Cx酶Ⅰ；4.Cx酶Ⅱ.d.SDS-PAGE：1.粗酶；2.低分子質量標準蛋白；3.Cx酶Ⅲ；4.Cx酶Ⅳ.

圖6 溫度對粗酶液中內切型纖維素酶活力的影響

圖7 pH對粗酶液中內切型纖維素酶活力的影響

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(責任編輯：趙藏賞)

PurificationandidentificationofendocellulasesfromAspergillusoryzaeHuniang3.042

WUJin-xia1,CHANGShu-ying1,SUNPeng1,ZHANGYong-kuo1,ZHANGHe-ying2

(1.College of Life Sciences, Hebei University, Baoding 071002,China; 2.Research Center for Biotechnology, Hebei University, Baoding 071002,China)

The crude enzyme solution fromAspergillusoryzaeHuniang 3.042 mature Koji was extracted for the purpose of revealing the roles of cellulases in the process of material decomposing, and the activity of exocellulase ,endocellulase andβ-glucosidase was analyzed by DNS method .Four Cx enzymes were identified by Congo red staining, called as Cx enzyme Ⅰ, Cx enzyme Ⅱ , Cx enzyme Ⅲ and Cx enzyme Ⅳ respectively in this article.DEAE-Cellulose-52 ion exchange chromatography was used to primarily separate endocellulases in the crude enzyme solution, it was found that the elution peak of 0.15, 0.20 ,0.25, 0.30 mol/L NaCl contained the active components.Then, four purified Cx enzymes were obtained by preparative electrophoresis.First three Cx enzymes were monomeric enzyme and their molecular mass were 31 800，34 000, 26 000 u respectively determined by SDS-PAGE, the last one contained four subunits ,and their molecular mass were 14 000，23 600，26 000,33 500 u respectivly.The optimal temperature of endocellulases in the crude enzyme solution was 50 ℃，and the optimal pH was 4.0.

Aspergillusoryzae; endocellulases; Congo red staining; ion exchange chromatography; preparative electrophoresis

Q814.1;Q556.2

A

1000-1565(2012)01-0068-07

2011-06-25

河北大學博士基金資助項目

武金霞(1966-)，女，河北曲陽人，河北大學教授，博士，主要從事生物化學與生物工程藥物研究.

E-mail:wjx6@163.com