丹參注射液聯合骨髓干細胞移植治療腦梗死肢體癱瘓的臨床研究

鄧英光，張紫萍，余 衛

腦梗死是常見病、多發病，提高患者生活質量已成為醫學研究的重要課題。近年來隨著骨髓干細胞 (MSC)生物學研究的不斷深入，發現某些MSC不但能再生其特定細胞，而且在一定環境下可轉變生成其他組織系統的細胞，這是20世紀末MSC領域的突破性進展之一［1］。我院神經科從2008年9月開始，試用丹參聯合自體MSC移植，通過新生血管重建動脈側支循環和改善血流，修復缺血組織和損傷的神經，從而緩解癱瘓肢體癥狀，改善腦梗死肢體癱瘓患者的不良預后。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院神經內科30例腦梗死肢體癱瘓患者。病例納入標準:(1)符合全國第四次腦血管會議制定的《腦血管疾病分類 (1995)》腦梗死的診斷標準［2］;(2)年齡18～80歲;(3)第1次患腦梗死發病3d內入院，治療2～3周出院;(4)出院時無意識障礙，單側或雙側肢體肌力＞Ⅰ級，＜Ⅳ級。排除標準:(1)藥物過敏者;(2)有嚴重心、肝、腎等疾病者;(3)有嚴重精神障礙者;(4)難以隨訪者。

1.2 方法

1.2.1 分組 將30例腦梗死肢體癱瘓確診患者 (包括初次確診患者和已接受傳統療法治療無效者)分為丹參治療組 (對照組)15例，丹參配伍MSC治療組 (治療組)15例。

1.2.2 MSC體外培養 無菌條件局麻下骨穿抽取患者自體50ml新鮮骨髓液，PBS稀釋1倍后，輕輕疊加到50ml Ficol分離液上，在常溫下1500r/min，離心20min，分離出單核細胞，用加拿大Mesencult培養液重新懸浮細胞，調整細胞濃度為(1～5)×106/ml，接種于175cm2的細胞培養瓶中 (每瓶15ml)，放置于飽和濕度、37℃、5%CO2的培養箱中。3d后更換培養液，棄掉未貼壁的懸浮細胞，10d后傳代，0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化貼壁細胞，將細胞重新懸浮，按1∶2比例傳代。4d后半量換一次液，7d后0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化收獲細胞。

1.2.3 MSC的鑒定 MSC的鑒定通過流式細胞儀檢測細胞表面CD34、CD45、CD73、CD90、CD105的表達，MSC 的特點是，并同時監測細菌污染指標。

1.2.4 移植方案 采用靜脈滴注作為移植途徑，根據收獲的細胞數量確定移植次數，每次為 (1～5)×107個細胞。MSC治療組按1、3、5d 3次靜脈輸注MSC，輸注前30～60min靜脈滴注20%甘露醇250ml增強血腦脊液屏障的通透性。

1.2.5 臨床治療方案 對照組:丹參注射液10ml加入5%葡萄糖溶液250ml中，靜脈滴注，1次/d，連續14d。治療組在輸注MSC前1d開始連續使用丹參注射液14d。

1.3 療效評估

1.3.1 美國國立衛生研究院卒中 (NIHSS)量表［3］采用NIHSS評定患者神經功能缺損程度。臨床療效根據治療前后NIHSS評分的變化及殘障水平評定:(1)基本痊愈:NIHSS評分減少90%～100%，殘障水平0級;(2)顯著進步:NIHSS評分減少46% ～89%，殘障水平l～3級;(3)進步:NIHSS評分減少18%～45%;(4)無變化:NIHSS評分減少或增加＜18%;(5)惡化:NIHSS評分增加≥18%;(6)死亡。

1.3.2 比較功能綜合評定 (FCA)量表 每個項目滿分6分，最低分1分。本研究選取其中5個觀測內容 (自我照料、括約肌控制、轉移、行走、上下樓梯)，即軀體功能評定，共分為13個項目觀測內容，滿分78分，最低分13分。

1.3.3 主要觀察指標 以CT血管三維重建和彩色多普勒檢查，觀察動脈側支循環和腦梗死區域血流重建情況;檢查血、尿、便常規、肝、腎功能、心電圖等，全面了解患者病情。

1.4 安全性評估 觀察丹參注射液及MSC移植治療期間的不良反應。

1.5 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件進行數據處理。計量資料以(±s)表示，組間比較采用t檢驗，兩兩比較采用方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NIHSS、FCA量表評分結果 兩組治療前與治療后14d和治療后28d NIHSS、FCA量表評分比較，差異均有統計學意義 (P＜0.05);對照組治療后14d和18d的NIHSS及FCA分別與治療組比較，差異均有統計學意義 (P＜0.05，見表1)。

2.2 客觀評價標準 治療1個月后腦血管造影CT三維重建和彩色多普勒檢查示腦梗死區域有一定數量的新生側支血管。

2.3 不良反應 治療后患者無發熱反應及其他不適感，血、尿、便常規、肝、腎功能、心電圖等檢查未見特殊改變。

表1 兩組治療前后NIHSS、FCA比較(±s)Table 1 Comparison of NIHSS and FCA before and after the treatment between two groups

表1 兩組治療前后NIHSS、FCA比較(±s)Table 1 Comparison of NIHSS and FCA before and after the treatment between two groups

注:與同組治療前比較，*P＜0.05;與對照組比較，#P＜0.05

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3 討論

近年來關于MSC的生物學研究表明，MSC具有多向分化潛能，其攜帶了人體全部基因組，可同時對骨骼肌、心肌和神經系統等受損組織進行修復［4］。MSC中的內皮祖細胞為促血管新生細胞，能分化為血管內皮細胞而誘導血管形成，使細胞移植治療缺血性疾病的研究取得了突破性的進展［5］。Kalka等［6］試驗證明，直接移植骨髓間充質干細胞 (BMSCs)可增強一些缺血性疾病的血管生長，在缺血局部可橫向分化為血管內皮細胞，并進一步分化形成新生毛細血管，形成新的側支，改善患者局部血供。而且Chen等［7］采用腦損傷組織勻漿進行體外MSC培養發現，在含有腦損傷組織勻漿的培養環境下，MSC能產生多種神經營養因子，包括神經生長因子 (NGF)、腦源性神經營養因子 (BDNF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和血管內皮生長因子 (VEGF)，為中樞神經系統移植MSC促進神經再生，改善中樞神經系統損傷后的生物學行為提供了分子生物學證據。

治療組在脫水、調控血壓、防止血小板聚集和改善腦供血等腦梗死肢體癱瘓常規治療基礎下，再用丹參注射液聯合MSC移植治療，結果顯示，兩組患者治療后14d和28d時的NIHSS和FCA評分均有改善，且治療組的評分均優于對照組(P＜0.05)，這說明丹參注射液聯合MSC移植治療對改善腦梗死肢體癱瘓患者的神經功能缺失，恢復患者的部分身體功能，使得患者恢復到患病前一定的日常生活能力。推測其機制可能包括:(1)丹參對于促進創傷修復再生、改善局部微循環、減輕組織缺血再灌注損傷等方面都具有較好作用。丹參多酚酸鹽是丹參水溶性活性部位，其能夠促進單核細胞合成和分泌VEGF、bFGF，進而促進內皮細胞的遷移，推測丹參多酚酸鹽促進內皮細胞遷移可能是促血管生成的機制之一［8］。 (2)MSC的神經細胞分化潛能可產生某種程度的神經再生，修復梗死腦組織［9］，而且MSC具有透過血腦脊液屏障和向病損部位遷移的能力［10］。(3)MSC在腦梗死區域可產生一系列BDNF和VEGF，起到神經保護和血管再生的作用［7］。但具體的作用機制尚未明確，有待進一步的研究驗證。

培養得到的BMSCs靜脈輸注后，至今未觀察到嚴重不良反應，初步說明此技術方法是安全的。本組病例數少，觀察時間尚短，必須密切關注安全方面的問題，有待進一步進行大規模臨床試驗加以驗證。

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4 張成.骨髓干細胞移植在神經疾病中的應用前景［J］.醫學文選，2003，22(5):1-3.

5 Asahara T，Murohara T，Sullivan A，et al.Isalation of putative progenitor Endothelial cell for angiogenesis ［J］.Science，1997，275(2):964-967.

6 Kalka C，Masuda H，Takahashi T，et al.Transpantation of exvivo expanded endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(7):3422-3427.

7 Chen X，Kalakowshi M，Li Y，et al.Human bone marrow stromal cell cultures conditioned by traumatic brain tissue extracts growth factor production ［J］.J Neuro Sci Res，2002，69:687-691.

8 杜建時，孫大軍.丹參及血管內皮生長因子對動物肢體缺血模型側支循環建立的作用［J］.吉林大學學報 (醫學版)，2003，29(3):294-297.

9 陳運賢，陸英，鐘雪云，等.粒細胞集落刺激因子動員骨髓干細胞治療大鼠缺血性腦梗死［J］.中國病理生理雜志，2004，20(6):560-565.

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