法舒地爾對(duì)高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的抑制作用

倪連松，高 倩，顧玲佳

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，浙江溫州 325000)

法舒地爾是最早發(fā)現(xiàn)的Rho相關(guān)卷曲螺旋形成的蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶(Rho-associated coiledcoil forming protein serine/threonine kinase，ROCK)選擇性抑制劑之一［1］。已有研究表明，在糖尿病動(dòng)物模型中法舒地爾可以減少尿蛋白、腎小球系膜外基質(zhì)堆積以及減輕腎小球硬化［2－5］。近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明，糖尿病時(shí)腎小管間質(zhì)病變的嚴(yán)重程度與蛋白尿排泄量和腎功能的進(jìn)行性下降密切相關(guān)［6］，然而法舒地爾對(duì)糖尿病性腎小管間質(zhì)病變的保護(hù)作用尚未見(jiàn)報(bào)道。Rho家族蛋白是Ras超家族中小分子G蛋白的成員之一，具有GTP酶活性，故又稱Rho GTP酶，其中對(duì)Rho A，Rac1和Cdc42研究得最為廣泛。Rho A分子存在著與GTP結(jié)合激活態(tài)和與GDP結(jié)合失活態(tài)兩種，在兩種形式相互轉(zhuǎn)換過(guò)程中轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，行使其生理功能。ROCK又稱Rho激酶，是Rho A下游的主要效應(yīng)因子。近來(lái)人們發(fā)現(xiàn)，腎中Rho A/ROCK信號(hào)通路具有重要的功能，Rho A/ROCK介導(dǎo)了腎小管細(xì)胞、系膜細(xì)胞及足細(xì)胞的細(xì)胞支架的重構(gòu);促成了上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化，因而在腎纖維化中起著重要的作用［7］。細(xì)胞在某些生理或病理情況下發(fā)生細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的改變稱為細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，其中上皮細(xì)胞在某些條件下轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞的現(xiàn)象稱為上皮細(xì)胞肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epithelial-myofibroblast transition，EMT)［8］，表現(xiàn)為丟失上皮細(xì)胞標(biāo)志物上皮鈣黏素［9］，以及表達(dá)肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)。已有研究顯示，糖尿病性腎病時(shí)腎小管上皮細(xì)胞可發(fā)生轉(zhuǎn)分化，并且該轉(zhuǎn)分化過(guò)程在糖尿病性腎病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［10］，尋找新的干預(yù)措施逆轉(zhuǎn)該轉(zhuǎn)分化過(guò)程將是治療糖尿病性腎病的新策略。

為進(jìn)一步探究法舒地爾對(duì)糖尿病性腎病的保護(hù)作用機(jī)制，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇在安全濃度范圍內(nèi)的最大濃度20μmol·L－1作為法舒地爾的實(shí)驗(yàn)濃度，探討其對(duì)高糖培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化影響，同時(shí)檢測(cè)其對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor，TGF-β1)的影響，以探討其作用機(jī)制并為其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器

人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCC編號(hào):GDC152。法舒地爾購(gòu)自天津紅日藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào):091114。DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品。Rho A配體結(jié)合沉淀試劑盒購(gòu)自Millipore公司。鼠抗人Rho A一抗，鼠抗人上皮鈣黏素一抗和鼠抗人α-SMA購(gòu)自Sant Cruz公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體購(gòu)自聯(lián)科生物公司。HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體和碘化丙啶(propidium iodide，PI)購(gòu)于碧云天公司。激光共聚焦儀器為Olympus公司，酶標(biāo)儀為T(mén)hermo公司，Imaglab凝膠成像系統(tǒng)為Bio-Rad公司，ELISA試劑盒購(gòu)自上海西唐公司。

1.2 HK-2細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理

HK-2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在含10%胎牛血清和葡萄糖5.5 mmol·L－1的 DMEM 培養(yǎng)液中，置 37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，2～3 d換液1次。細(xì)胞依次分別加入葡萄糖 5.5 mmol·L－1、葡萄糖 5.5 mmol·L－1+甘露醇 54.5 mmol·L－1、葡萄糖 60 mmol·L－1及葡萄糖 60 mmol·L－1+ 法舒地爾 20 μmol·L－1。

1.3 配體結(jié)合沉淀法檢測(cè)Rho A活性

HK-2細(xì)胞接種在10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞培養(yǎng)貼壁生長(zhǎng)至100%融合后，無(wú)血清培養(yǎng)液靜止培養(yǎng)24 h后用葡萄糖60 mmol·L－1的高糖培養(yǎng)液干預(yù)，分別于0，0.5，1，3，7，12 和24 h收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞后，收集的細(xì)胞，于4℃時(shí)，17949×g離心30 min，取50μl上清用于Total-RhoA檢測(cè)，余上清加入10μl Rhotekin Rho結(jié)合域瓊脂糖 (Rhotekin Rho binding domain agarose，Rhotekin RBD-agarose)，4℃振搖過(guò)夜以沉淀GTP-Rho A，變性后取50μl樣本行12%SDS-PAGE電泳，Western印跡法檢測(cè) GTPRhoA的表達(dá)，同時(shí)取50μl總蛋白樣品檢測(cè)總Rho A的表達(dá)。Imagelab軟件分析結(jié)果，以所測(cè)得的各條帶的積分吸光度(integrated absorbance，IA)與相應(yīng)總Rho A的IA比值作為Rho A活性值。

1.4 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)上皮鈣黏素表達(dá)

收集培養(yǎng)72 h的各分組細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛溶液固定和0.1%TritonX-100溶液穿孔細(xì)胞后用10%正常羊血清37℃封閉1 h，滴加上皮鈣黏素一抗(1∶100)，4℃孵育過(guò)夜，次日清洗后滴加FITC標(biāo)記的二抗(1∶200)避光37℃孵育30 min，后行PI染色30 min，清洗后用抗熒光淬滅封片劑封片，立即用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍片，每組隨機(jī)選3個(gè)視野用圖像分析軟件進(jìn)行分析，IA與視野總面積的比值表示上皮鈣黏素表達(dá)量。

1.5 Western印跡法檢測(cè)α-SMA的表達(dá)

1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

HK-2細(xì)胞接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞培養(yǎng)貼壁生長(zhǎng)至70%融合后，更換為無(wú)血清培養(yǎng)液靜止24 h，按實(shí)驗(yàn)分組換為不同的培養(yǎng)液，分別于72 h提取細(xì)胞蛋白。

1.5.2 細(xì)胞總蛋白提取與定量

收集細(xì)胞后，冰上裂解細(xì)胞30 min，收集裂解液5 min，4℃，17 949×g離心后收集上清用BCA蛋白濃度測(cè)定法測(cè)定蛋白濃度，操作按說(shuō)明書(shū)。5×上樣緩沖液變性蛋白后－20℃保存。

1.5.3 細(xì)胞內(nèi)α-SMA蛋白量的檢測(cè)

取60μg總蛋白上樣，用10%濃度的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳。恒流將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉2 h，分別加入 α-SMA(1∶200)，GAPDH(1∶1000)一抗，4℃過(guò)夜。清洗后分別加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的Ig G(1∶1000)二抗，室溫?fù)u床孵育1 h，洗膜后分別取等量ECL試劑盒溶液A和B液混合后加于PVDF膜，避光反應(yīng)1 min，Molecular Imager ChemiDocTMXRS和成像系統(tǒng)自動(dòng)曝光掃描并用Imagelab軟件分析結(jié)果，以所測(cè)得的各條帶的A與內(nèi)參照GAPDH A的比值作為α-SMA的半定量值。

1.6 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清TGF-β1含量

收集培養(yǎng)24 h和48 h細(xì)胞上清液4℃，4142×g離心3 min后ELISA法檢測(cè)TGF-β1，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)。收集細(xì)胞冰上裂解后離心，收集上清用BCA蛋白濃度測(cè)定法測(cè)定蛋白濃度，操作按說(shuō)明書(shū)，以矯正ELISA結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 高糖對(duì)HK-2細(xì)胞Rho A活性的影響

圖1結(jié)果顯示，與未刺激前(0 min)比較，高糖60 mmol·L－1培養(yǎng)3 ～24 h后 HK-2 細(xì)胞 Rho A 活性明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，其中3 h為最高，是為刺激前的4.5倍，提示在一定時(shí)間范圍內(nèi)，高糖可以刺激HK-2細(xì)胞Rho A分子活化。

2.2 法舒地爾對(duì)高糖培養(yǎng)HK-2細(xì)胞上皮鈣黏素表達(dá)的影響

如表1和圖2結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，高糖60 mmol·L－1培養(yǎng)72 h后HK-2細(xì)胞內(nèi)上皮鈣黏素蛋白表達(dá)明顯減少(P＜0.01)，高張組區(qū)別不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示高糖可成功誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換，高張并不能引起HK-2細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換。與高糖組比較，法舒地爾20μmol·L－1同步干預(yù)72 h后上皮鈣黏素蛋白表達(dá)量增多，但仍低于正常對(duì)照組，提示法舒地爾20μmol·L－1不能完全抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。

Fig.1 Effect of high glucose on Rho A activity of HK-2 cells.B was the semiquantitative result of A.Lanes 1－7 were HK-2 cells cultivated with glucose60 mmol·L－1 for 0，0.5，1 ，3 ，7 ，12 and 24 h，respectively.±s，n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with 0 min group.

Tab.1 Effect of fasudil on E-cadherin expression of HK-2 cells cultivated in high glucose

Fig.2 Effect of fasudil on E-cadherin expression of HK-2 cells cultivated in high glucose detected by confocal laser scanning microscopy(PI×400).See Tab 1 for the treatment.A:normal control group;B:high tension group;C:high glucose group;D:high glucose+fasudil group.

2.3 法舒地爾對(duì)高糖培養(yǎng)HK-2細(xì)胞α-SMA表達(dá)的影響

如圖3結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，高糖60 mmol·L－1培養(yǎng)HK-2 細(xì)胞72 h 后，細(xì)胞 α-SMA 蛋白表達(dá)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，高張組差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示是高糖可以誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而高張培養(yǎng)不能誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)化。與高糖組比較，法舒地爾20μmol·L－1同步干預(yù)72 h后HK-2細(xì)胞α-SMA表達(dá)量明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用能被法舒地爾抑制。

Fig.3 Effect of fasudil on α-smooth muscle actin(α-SMA)expression of HK-2 cells cultivated in high glucose detected by Western blotting.See Tab.1 for the treatment.B was the semiquantitative result of A.1－4 were normal control group，high tension group，high glucose group and high glucose+fasudil group，respectively.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group;#P ＜0.05，compared with high glucose group.

2.4 法舒地爾對(duì)高糖培養(yǎng)HK-2細(xì)胞TGF-β1分泌的影響

表2結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，高糖60 mmol·L－1培養(yǎng)24或48 h可增加HK-2細(xì)胞上清液中TGF-β1的合成，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加(P ＜0.01)。法舒地爾20 μmol·L－1同步干預(yù)24 或48 h后，對(duì)高糖刺激HK-2細(xì)胞TGF-β1的合成作用具有明顯抑制作用，但法舒地爾同步干預(yù)24 h不能完全抑制高糖的刺激作用。

Tab.2 Effect of fasudil on transforming growth factor-β1(TGF-β1)secretion of HK-2 cells cultivated in high glucose

3 討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HK-2細(xì)胞在高糖60 mmol·L－1條件下培養(yǎng)72 h后，上皮鈣黏素表達(dá)下降，α-SMA表達(dá)升高，發(fā)生EMT，與 Zhou等［11］的研究結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)高糖60 mmol·L－1能激活HK-2細(xì)胞Rho A活性，表現(xiàn)為GTP-Rho A與總Rho A的比值增加，進(jìn)一步補(bǔ)充了Massey等［12］關(guān)于糖尿病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腎皮質(zhì)存在Rho A的活化的研究結(jié)果，為研究法舒地爾對(duì)高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用提供了理論依據(jù)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖 60 mmol·L－1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，能部分被法舒地爾抑制，表現(xiàn)為經(jīng)法舒地爾同步干預(yù)后，細(xì)胞上皮鈣黏素表達(dá)增加，α-SMA表達(dá)下降，證實(shí)了法舒地爾對(duì)糖尿病性腎小管間質(zhì)病變的保護(hù)作用，也進(jìn)一步闡明了法舒地爾的糖尿病性腎病保護(hù)作用機(jī)制，但是本研究還發(fā)現(xiàn)，法舒地爾不能完全抑制EMT，法舒地爾干預(yù)組與正常糖濃度培養(yǎng)組表型標(biāo)志物表達(dá)量存在的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示高糖可能還通過(guò)Rho A/ROCK通路以外的信號(hào)通路誘導(dǎo)EMT。Lee等［13］就曾報(bào)道PI3K/Akt在高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞EMT中起重要作用。

TGF-β1是公認(rèn)致纖維化的細(xì)胞因子，在糖尿病性腎病的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。有研究顯示TGF-β1可以導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生 EMT［14］。本研究顯示HK-2細(xì)胞在高糖60 mmol·L－1培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24和48 h，HK-2細(xì)胞上清液中TGF-β1明顯增多，且隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)而增多，因此高糖刺激HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT可能與TGF-β1介導(dǎo)有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)法舒地爾同步干預(yù)后，HK-2細(xì)胞上清中的TGF-β1明顯減少，表明法舒地爾抑制腎小管上皮轉(zhuǎn)分化可能部分是通過(guò)抑制TGF-β1的產(chǎn)生而介導(dǎo)的。法舒地爾對(duì)正常糖濃度培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞TGF-β1分泌的影響尚有待研究。

總之，本研究結(jié)果顯示，高糖能誘導(dǎo)培養(yǎng)HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT，并能激活Rho A分子;Rho A/ROCK通路抑制劑法舒地爾能明顯抑制該轉(zhuǎn)分化過(guò)程;法舒地爾抑制腎小管上皮轉(zhuǎn)分化的作用可能部分是通過(guò)抑制TGF-β1生成而介導(dǎo)的。

［1］Liao JK，Seto M，Noma K.Rho kinase(ROCK)inhibitors［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2007，50(1):17-24.

［2］Gojo A，Utsunomiya K，Taniguchi K，Yokota T，Ishizawa S，Kanazawa Y，et al.The Rho-kinase inhibitor，fasudil，attenuates diabetic nephropathy in streptozotocin-induced diabetic rats［J］.Eur J Pharmacol，2007，568(1-3):242-247.

［3］Peng F，Wu D，Gao B，Ingram AJ，Zhang B，Chorneyko K，et al.RhoA/Rho-kinase contribute to the pathogenesis of diabetic renal disease［J］.Diabetes，2008，57(6):1683-1692.

［4］Kikuchi Y， Yamada M， Imakiire T， Kushiyama T，Higashi K，Hyodo N，et al.A Rho-kinase inhibitor，fasudil，prevents development of diabetes and nephropathy in insulin-resistant diabetic rats［J］.J Endocrinol，2007，192(3):595-603.

［5］Kolavennu V，Zeng L，Peng H，Wang Y，Danesh FR.Targeting of RhoA/ROCK signaling ameliorates progression of diabetic nephropathy independent of glucose control［J］.Diabetes，2008，57(3):714-723.

［6］Gilbert RE，Cooper ME.The tubulointerstitium in progressive diabetic kidney disease:more than an aftermath of glomerular injury［J］?Kidney Int，1999，56(5):1627-1637.

［7］Hayashi K，Wakino S，Kanda T，Homma K，Sugano N，Saruta T.Molecular mechanisms and therapeutic strategies of chronic renal injury:role of rho-kinase in the development of renal injury［J］.J Pharmacol Sci，2006，100(1):29-33.

［8］Yang J，Liu Y.Blockage of tubular epithelial to myofibroblast transition by hepatocyte growth factor prevents renal interstitial fibrosis［J］.J Am Soc Nephrol，2002，13(1):96-107.

［9］Cheng HX，Yang XP，Zhao J.E-cadherin and renal interstitial fibrosis［J］.J Clin Exp Med(臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志)，2010，15(9):1184-1187.

［10］Li J，Qu X，Bertram JF.Endothelial-myofibroblast transition contributes to the early development of diabetic renal interstitial fibrosis in streptozotocin-induced diabetic mice［J］.Am J Pathol，2009，175(4):1380-1388.

［11］Zhou L，Xue H，Yuan P，Ni J，Yu C，Huang Y，et al.Angiotensin AT1 receptor activation mediates high glucose-induced epithelial-mesenchymal transition in renal proximal tubular cells［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2010，37(9):e152-e157.

［12］Massey AR， Miao L， Smith BN， Liu J，Kusaka I，Zhang JH，et al.Increased RhoA translocation in renal cortex of diabetic rats［J］.Life Sci，2003，72(26):2943-2952.

［13］Lee YJ，Han HJ.Troglitazone ameliorates high glucoseinduced EMT and dysfunction of SGLTs through PI3K/Akt，GSK-3β，Snail1，and β-catenin in renal proximal tubule cells［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2010，298(5):1263-1275.

［14］Lan HY.Tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation mechanisms in proximal tubule cells［J］.Curr Opin Nephrol Hypertens，2003，12(1):25-29.