地西他濱聯合丙戊酸增強HL-60細胞hPer3基因的表達

李翊衛，王曄愷，周吉航，周世權，曾 芳，劉曉光

(舟山醫院1.檢驗科，2.細胞分子生物學實驗室，浙江舟山 316004)

地西他濱(decitabine，DCA)主要用于治療中高危骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes，MDS)。前期研究發現急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)患者疾病進程和時鐘基因human period3(hPer3)的表達及啟動子甲基化程度存在相關性，體外AML細胞株HL-60中利用DCA恢復了hPer3的部分表達并減弱了其啟動子的高甲基化程度［1］。

在國外臨床試驗中，DCA對原發性AML的療效不佳，單用效果往往不如與某些組蛋白去乙酰化酶抑制劑藥物如丙戊酸(valproic acid，VPA)等聯合使用［2］。因此，通過觀察DCA和VPA聯用對原發性AML細胞株HL-60中hPer3基因的表達調控，初步探討DCA和VPA聯用治療原發性AML的可能機制。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器

對苯二酚、亞硫酸氫鈉、氯仿和氫氧化鈉購自上海晶純試劑有限公司，注射用地西他濱購自西安楊森制藥有限公司，注射用丙戊酸鈉購自賽諾菲-安萬特公司，FITC標記的膜聯蛋白-碘化丙啶(FITC-AnnexinⅤ/PI)凋亡試劑盒和CD14-FITC均購自美國BD公司，DNA提取純化試劑盒和普通PCR擴增試劑盒購自美國Promega公司，DNA標志物購自廣州東盛生物科技有限公司，Trizol購自美國Invitrogen公司，CpG甲基轉移酶(CpG methyltransferase，M.SssI)購自北京New England Biolabs(NEB)有限公司，pMD18載體試劑盒和熒光定量PCR試劑盒(Syber GreenⅠ)購自大連TaKaRa生物工程有限公司，MTT試劑盒、小牛血清和1640培養液購自碧云天生物技術研究所。MS-PCR引物:甲基化甲基化條帶引物:MSF-S:5'-CGGGAGTTTTGGGTATTCGC-3'，MSF-A:5'-CGACCCGACTAACTAAAACG-3'，甲基化產物 182 bp;非甲基化條帶引物:USF-S:5'-TGGGTGGTTGGGTGGGAGTTTTGGGTATTTGT-3'，USF-A:5'-AATCCAA-CACCAACAACCCAACTAACTAAAACA-3'，非 甲 基 化產物207 bp;熒光定量 PCR引物:hPer3-S:5'-ACAAACAGAACCACAAGGCA-3'，hPer3-A:5'-CGTCCATTTGTTGGCATTT-3'，擴增產物94 bp;GAPDH-S:5'-GACCTGACCTGCCGTCTA-3'，GAPDH-A:5'-AGGAGTGGGTGTCGCTGT-3'，擴增產物148 bp;均由上海生工生物工程公司合成。凝膠成像系統為美國Bio-Rad公司Universal HoodⅡ型，凝膠成像分析軟件為美國Bio-Rad公司Quantity One，普通PCR儀為Roche Mycycle，熒光 PCR 儀為 Roche Lightcycle，CO2培養箱為德國Jouan IG150，酶標儀為美國Bio-Rad公司680型，流式細胞儀為美國BD FACSCalibur，獲取軟件為 CellQuest，冰凍離心機為 Eppendorf 5714R，熒光顯微鏡為日本Olympus BX51。

1.2 生物信息學分析

從MethDB數據庫中選取hPer3啟動子中富含CpG島的－465～－269位點區域利用ABI MethPrimer軟件設計甲基化引物:MSF-S:(－453～－444)，MSF-A:(－281～－301);非甲基化引物:USF-S:(－465～ －444)，USF-A:(－269～ －301)。

1.3 細胞培養及藥物處理

AML細胞株HL-60購自中科院上海細胞庫。用含10%小牛血清的RPMI 1640培養液在37℃、5%CO2的培養箱中培養，取對數期細胞備用。配制密度為1×108L－1的細胞懸液接種于6孔培養板，每孔2 ml，置于37℃，5%CO2和飽和濕度的培養箱中培養過夜，按照分組分別加入終濃度為 DCA 1.0 和 4.0 μmol·L－1，VPA 2.0 mmol·L－1，DCA 1.0 μmol·L－1+VPA 2.0 mmol·L－1，DCA 4.0 μmol·L－1+VPA 2.0 mmo·L－1，每組設 6 復孔，作用48 h后各孔吸出培養液，PBS洗1次，吸棄PBS后進行實驗。

1.4 MTT法檢測細胞存活

1.3中細胞加培養液180μl，實驗終止前加20 μl MTT 5 g·L－1，繼續培養4h;控干液體，每孔加150 μl DMSO，96孔震蕩板低速混勻10 min。酶標儀選擇波長490 nm，測定各組各孔吸光度(A)值。生長抑制率(inhibitory rate，IR)(%)=(1 － A實驗組/A對照組)×100%。另取細胞沉淀涂片，在倒置熒光顯微鏡下觀察各實驗組細胞的變化。

1.5 FITC-AnnexinⅤ/PI標記法觀察細胞凋亡

1.3步驟中細胞用預冷PBS洗滌棄上清，殘渣細胞收集至流式管。每管加5μl AnnexinⅤ-FITC和10 μl PI，避光靜置 15 min，加 300 μl預冷的PBS，振蕩混勻上機檢測其早期凋亡率。

1.6 實時熒光定量PCR檢測hPer3 mRNA表達

用Trizol提取細胞總RNA，鑒定完整性和純度，取5μg總RNA冰上逆轉錄成cDNA進行逆轉錄PCR，反應體系 25 μl:其中 DNA 模板 2 μl，10 μmol·L－1的hPer3或GAPDH熒光定量PCR引物各1μl，5×PCR緩沖液5μl，加去RNA酶水補至25μl，反應條件:95℃ 10 min;95℃ 20 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，30 循環;72℃ 10 min。PCR反應產物經純化后，加入5μl連接緩沖液、4.5 μl純化的目的片段、pMD18-T 載體0.5 μl，低速離心后于16℃連接過夜，將連接液轉化大腸桿菌DH5α后涂氨芐西林平板，挑取單菌落培養過夜，抽提其質粒通過PCR鑒定陽性重組子，送上海生工公司測序確證。將重組質粒倍比梯度稀釋做為標準品，而樣本cDNA用Syber GreenⅠ熒光染料嵌合法進行檢測，反應體系參照試劑說明書，反應條件:95℃ 5 min;94℃30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 循環;72℃ 10 min，利用各自的標準曲線分別對樣品中的目的基因和內參基因進行定量，以hPer3基因拷貝數與GAPDH基因拷貝數比值表示細胞中hPer3 mRNA的相對表達量。

1.7 MS-PCR檢測hPer3基因啟動子甲基化

采用苯酚氯仿法抽提白血病細胞株基因組DNA，采用紫外分光光度計測量測定吸光度，確定其純度。吸取4μl基因組DNA至40μl去離子水中，加10 μl氫氧化鈉3 mol·L－1，37℃孵育20 min，加入30 μl的對苯二酚 10 mmol·L－1和 520 μl亞硫酸氫鈉 1.5 mol·L－1，50℃孵育16 h，應用 DNA 純化試劑盒純化回收，加入 50 μl氫氧化鈉1 mol·L－1，室溫放置5 min終止修飾，無水乙醇沉淀離心回收，室溫干燥后加入20μl去RNA酶水重懸，－20℃保存備用。

以ddH2O為空白對照，用經M.SssⅠ處理后的基因組 DNA為陽性對照。反應體系25μl，其中DNA模板2μl，甲基化或非甲基化正反向引物10 μmol·L－1各1 μl，5 × PCR 緩沖液 5 μl，加去離子水補至 25μl。95℃預變性 15 min;94℃ 50 s，56℃ 40 s，72℃ 60 s，35 個循環;72℃ 5 min，完成擴增反應，產物用2%瓊脂糖電泳，凝膠成像儀紫外下觀察結果。完全和部分甲基化判定為甲基化陽性，無甲基化為甲基化陰性。

1.8 流式細胞儀檢測CD14表達

1.3步驟中細胞用預冷PBS洗滌棄上清，殘渣細胞收集至流式管。加10μl CD14，放置15 min孵育后PBS洗滌去除未結合熒光抗體，上機檢測CD14陽性率。CD14陽性率(%)=CD14陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 地西他濱聯合丙戊酸對HL-60細胞存活的影響

表 1 結果顯示，VPA 2.0 mmol·L－1+DCA 1.0 mmol·L－1聯合用藥組生長抑制率高于 DCA 1.0 μmol·L－1組和 VPA 2.0 mmol·L－1組，差異具有顯著統計學意義(P ＜0.01);VPA 2.0+DCA 4.0 聯合用藥組生長抑制率高于 DCA 4.0 μmol·L－1組和 VPA 2.0 mmol·L－1組，差異具有顯著統計學意義(P ＜0.01)。

Tab.1 Synergistic effect of decitabine(DCA)and valproic acid(VPA)on HL-60 survival

2.2 地西他濱聯合丙戊酸對HL-60細胞凋亡的影響

2.2.1 形態學改變

如圖1所示，DCA和VPA處理HL-60細胞后，細胞生長均受到抑制，細胞體積縮小變圓，可見不同形態的凋亡細胞(圖1B，C，D，E，F)。細胞膜皺縮，邊緣濃染致密，膜發泡成芽，形成凋亡小體脫落等(如箭頭所示)。并且，聯合用藥組的作用明顯強于單藥組。

2.2.2 AnnexinⅤ/PI雙染觀察細胞凋亡

所有給藥組早期和晚期凋亡率均高于對照組，差異具有顯著統計學意義(P＜0.01);VPA 2.0+DCA 1.0 聯合用藥組高于 DCA 1.0 μmol·L－1組和VPA 2.0 mmol·L－1組，差異具有顯著統計學意義(P ＜0.01);VPA 2.0+DCA 4.0 聯合用藥組高于DCA 4.0 μmol·L－1組和 VPA 2.0 mmol·L－1組，差異具有顯著統計學意義(P＜0.01)(圖2和表2)。

Fig.1 Synergistic effect of DCA and VPA on HL-60 morphological changes(×400).See Tab 1 for the legend.A:normal control;B:DCA 1.0 μmol·L －1;C:DCA 4.0 μmol·L －1;D:VPA 2.0 mmol·L －1;E:VPA 2.0+DCA 1.0;F:VPA 2.0+DCA 4.0.Arrow shows apoptosis body.

Fig.2 Synergistic effect of DCA and VPA on HL-60 apoptosis detected by AnnexinⅤ/PI staining.A:normal control;B:DCA 1.0 μmol·L －1;C:DCA 4.0 μmol·L －1;D:VPA 2.0 mmol·L －1;E:VPA 2.0+DCA 1.0;F:VPA 2.0+DCA 4.0.

Tab.2 Synergistic effect of DCA and VPA on HL-60 apoptosis

2.3 地西他濱聯合丙戊酸鈉對 HL-60細胞中hPer3 mRNA表達的影響

與正常對照組相比，所有給藥組hPer3 mRNA表達均顯著增高(P ＜0.01);VPA 2.0+DCA 1.0 聯合用藥組顯著高于 DCA 1.0 μmol·L－1組和 VPA 2.0 mmol·L－1組(P ＜0.01);VPA 2.0+DCA 4.0 聯合用藥組顯著高于 DCA 4.0 μmol·L－1組和 VPA 2.0 mmol·L－1組(P ＜0.01)(表 3)。

Tab.3 Synergistic effect of DCA and VPA on human period3 mRNA(hPer3 mRNA)expression of HL-60 cells

2.4 地西他濱聯合丙戊酸對HL-60細胞中hPer3啟動子甲基化狀態的影響

Fig.3 Methylation status of hPer3 promoter in HL-60 cell.See Tab.1 for the legend.M and U represent methylation and unmethylation.1:normal control;2:DCA 1.0 μmol·L －1;3:DCA 4.0 μmol·L －1;4:VPA 2.0 mmol·L －1;5:VPA 2.0+DCA 1.0;6:VPA 2.0+DCA 4.0.

圖3 結果顯示，HL-60中hPer3為完全甲基化狀態，DCA 1.0 和4.0 μmol·L－1處理后，高甲基化狀態均逐漸減弱，出現非甲基化條帶。VPA單獨作用無明顯去甲基化的作用，但VPA與DCA聯用組去甲基化作用加強。

2.5 地西他濱聯合丙戊酸對HL-60細胞CD14表達的影響

DCA 1 和4 μmol·L－1顯著增加HL-60 細胞CD14表達率(P ＜0.01)。VPA 2.0+DCA 1.0 聯合用藥組CD14 表達顯著高于DCA 1.0 μmol·L－1組和VPA 2.0 mmol·L－1組(P ＜0.01);VPA 2.0+DCA 4.0 聯合用藥組 CD14 表達顯著高于 DCA 4.0 μmol·L－1組和VPA 2.0 mmol·L－1組(P ＜0.01)(表4)。

Tab.4 Synergistic effect of DCA and VPA on CD14 expression of HL-60 cells

3 討論

表觀遺傳學藥物治療原發性AML已成為惡性血液疾病化療的研究熱點之一，本研究結果也顯示，兩種不同機制的表觀遺傳學藥物DCA和VPA聯用能增強對HL-60的生長抑制、促凋亡和促分化作用，并且這種作用可能與VPA通過增強DCA對hPer3基因啟動子去甲基化從而促hPer3基因表達有關。真核細胞基因表達調控途徑通常有轉錄水平調控、染色質結構調控、轉錄后水平調控、翻譯水平調控等，啟動子區域甲基化屬于轉錄水平調控的一種，如果CpG島的甲基化引起轉錄效率降低，那么其轉錄效率一般和甲基化程度存在相關性，如Na等［3］用MS-PCR和逆轉錄PCR觀察45例非小細胞肺癌患者GADD45家族基因啟動子甲基化和其基因的關系，發現GADD45G mRNA降低與甲基化存在顯著相關。Corn等［4］研究發現，E鈣黏素在白血病細胞株、AML和ALL中啟動子存在高甲基化，并引起E鈣黏素表達沉默。目前多數研究均表明DCA和VPA聯用在體外多種腫瘤細胞中均體現出較佳的抗腫瘤活性和恢復抑癌基因表達的效果，如LU等［5］在U266細胞中聯用DCA和VPA恢復抑癌基因rassf1a的表達，Luszczek等［6］發現DCA與VPA聯用引起小細胞肺癌DNA損傷。除了直接作用于細胞活性以外，兩類藥聯用還能間接增強部分腫瘤細胞的對外部處理因素的敏感性，如Cho等［7］觀察到兩類藥聯用能增強結腸癌細胞和乳腺癌細胞的輻射敏感性。這些都說明在表觀遺傳學調控中，組蛋白去乙酰化和DNA甲基化兩種機制可以相互協調，共同調控細胞活性和基因表達。

DCA主要的副作用為骨髓抑制導致血三系降低，進而引起感染風險的增加［8］，通常需要口服抗生素加以預防［9］。研究顯示，DCA雖能促進MDS細胞株向成熟髓系細胞分化，表達CD14和CD11b成熟髓系抗原，但這種促分化作用較低，最高只能使CD14和 CD11b抗原表達率提升到10%左右［10］。本研究顯示，VPA 2.0 mmol·L－1并不能明顯促進HL-60 細胞表達 CD14，但與 DCA 1.0 μmol·L－1聯用能大幅度促進HL-60表達CD14。CD14為脂多糖(lipoploysaccharide，LPS)受體，存在于單核細胞、巨噬細胞等細胞表面的白細胞分化抗原，識別、結合LPS，介導LPS性細胞反應，在LPS性炎癥反應、內毒素休克等病理反應中起重要作用［11］。本研究顯示，DCA和VPA體外聯用能促進CD14的表達，提示其增強了體外抗革蘭陰性菌能力。典型的革蘭陰性菌血癥是間歇性和機會性的，雖然這種菌血癥可能不影響健康人，但對化療后的AML患者則可產生嚴重后果，感染的初發部位通常在肺部、泌尿生殖道、胃腸道或軟組織，包括患有褥瘡潰瘍的皮膚。如果DCA和VPA在體內聯用也能促白血病細胞分化表達CD14，則有助于增強AML患者的抗革蘭陰性菌能力，但體內兩藥聯用是否也存在類似的效應，尚需進一步研究。

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