大補陰丸對真性性早熟模型大鼠的治療作用

陳永霞，程 敏，繆云萍，葉小弟，鄭高利

(1.浙江中醫(yī)藥大學藥學院藥理研究室，浙江杭州 310053;2.浙江省醫(yī)學科學院藥理研究室，浙江杭州 310013)

性早熟是指兒童青春期特征提早出現(xiàn)、生長發(fā)育異常的內分泌疾病，一般將女孩8歲和男孩9歲以前呈現(xiàn)第二性征定義為性早熟。性早熟可分為促性腺激素釋放激素(gonadotropin releasing hormone，GnRH)依賴型性早熟(真性性早熟)、非GnRH依賴型性早熟(假性性早熟)和不完全性性早熟［1］，其中以真性性早熟最為常見。中醫(yī)治療真性性早熟多采用滋陰降火、疏肝解郁和化痰散結等方法，以滋陰泄火法最為常用。大補陰丸作為滋陰泄火的代表方劑，臨床上發(fā)現(xiàn)可以治療真性性早熟，且療效顯著，但尚缺少具有嚴格實驗設計的臨床試驗報告，也未見有基礎性實驗研究報道。本研究采用達那唑誘導的真性性早熟大鼠模型［2］，通過半定量逆轉錄(RT)-PCR法對性早熟大鼠下丘腦調節(jié)青春期啟動的關鍵基因進行研究，以闡述大補陰丸對真性性早熟的治療作用，探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD清潔級未孕大鼠，250～300 g，由浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號:SCXK(浙)2008-0033。飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)實驗室，溫度19～29℃，濕度40% ～80%，照明時間每天8:00－17:00，全價營養(yǎng)配方飼料。雌雄2∶1配種，每天早晨定時查看陰栓，有陰栓的選用母鼠單獨飼養(yǎng)于塑料籠子中，貼上標簽，標簽寫明配種日期、陰栓日期和籠號。陰栓后第19天開始查看仔鼠出生情況，選擇出生5 d的雌性仔鼠用于實驗。

1.2 藥物和試劑

達那唑購自江蘇聯(lián)環(huán)藥業(yè)股份有限公司，批號:20090302，以乙二醇/乙醇(V∶V=1∶1)的混合液配制成12 g·L－1溶液，每只大鼠sc給予25μl;大補陰丸購自杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司，國藥準字Z33020137，批號:100807，碾細后用蒸餾水配成不同濃度的混懸液;亮丙瑞林(leuprorelin)購自杭州中肽生化有限公司，批號:CI-08-00118，以生理鹽水配成200 mg·L－1溶液。Trizol購自美國 Invotrigen公司;M-MLV逆轉錄酶、Taq酶、dNTP、RNAsin和 Oligo(dT)15均為美國Promega公司產(chǎn)品;促性腺激素釋放素(gonadotropin releasing hormone，GnRH)，Kiss-1和G蛋白偶聯(lián)受體54(G protein-coupled receptor 54，GPR54)引物合成與設計由上海生物工程有限公司完成，GnRH引物:上游5'-ACTCGTTAATGCCTGGCAAAAGG-3'，下游 5'-AGGCCAAAGGAGTTCCAGTT-3'，產(chǎn)物 225 bp;GPR54引物:上游 5'-CTTAGCATCTGGGTGGGTTC-3'， 下 游 5'-AGGTATAGGGCCAGCAGGTT-3'，產(chǎn)物 152 bp;Kiss-1引物:上游 5'-AGCACTGGTCCTATGGGTTG-3'，下游 5'-CAGACGTTCCAGAGCTCCTC-3'， 產(chǎn) 物 175 bp;β肌動蛋白上游5'-GTCGTACCACTGGCATTGTG-3'，下 游 5'-TCTCAGCTGTGGTGGTGAAG-3'， 產(chǎn) 物181 bp。

1.3 儀器

MOTIC生物顯微圖像采集分析系統(tǒng)為廈門麥奧迪克儀器公司產(chǎn)品;ALE200型電子分析天平為日本Libor公司產(chǎn)品;多功能酶標儀為美國Dynex公司產(chǎn)品;紫外分光光度計為德國Eppendorf公司產(chǎn)品;Sigma-Sartorius 1-15k型臺式低溫高速離心機為德國德國賽多利斯公司產(chǎn)品;MJ-Research PTC-200型PCR儀為杭州寶城生物技術有限公司產(chǎn)品;Alpha Innotech FC2型化學發(fā)光凝膠成像儀為杭州東勝創(chuàng)新生物科技有限公司產(chǎn)品;美國Bio-Rad電泳儀為杭州寶城生物技術有限公司產(chǎn)品。

1.4 動物分組及給藥

5日齡SD雌性大鼠60只，隨機分為正常對照組、模型組、亮丙瑞林陽性對照組及大補陰丸0.81，1.62 和3.24 g·kg－1組，共6 組，每組10 只。除正常對照組，其余各組大鼠均于分組當日一次性sc給予達那唑30μg·g－1，建立性早熟大鼠模型，陰門開啟日齡較正常對照組顯著提前說明模型成功。常規(guī)飼養(yǎng)至15日齡，大補陰丸組ig給予大鼠大補陰丸20 ml·kg－1，劑量分別為 0.81，1.62 和 3.24 g·kg－1，每天1次;正常對照組和模型組則ig給予自來水，陽性對照組 sc 給予亮丙瑞林 0.5 ml·kg－1，劑量為 100 μg·kg－1，每天1次。觀察大鼠的陰門開啟情況。當模型組大鼠陰門開啟數(shù)超過50%(33日齡)，停止給藥，所有大鼠股動脈放血處死。

1.5 子宮系數(shù)、卵巢系數(shù)、子宮壁厚度和卵巢黃體生數(shù)的測定

大鼠處死后，取子宮和卵巢稱濕重，計算子宮和卵巢系數(shù)=器官質量(mg)/體質量(g)×100，后甲醛中固定，常規(guī)制作組織病理切片，測量子宮壁厚度和卵巢黃體數(shù)。

1.6 下丘腦GnRH，Kiss-1和GPR54 mRNA表達水平的測定

1.6.1 下丘腦總RNA的提取

大鼠處死后，冰上迅速取腦組織并分離下丘腦，Trizol法提取下丘腦總RNA，紫外分光光度計測定RNA 濃度和純度，A260nm/A280nm比值在1.8 ～2.0。

1.6.2 逆轉錄與PCR擴增

逆轉錄總反應體系 20μl，42℃反應60 min，70℃ 15 min。PCR擴增總反應體系 25μl，94℃預變性 2 min，94℃ 變性 30 s，58℃ 退火 30 s，72℃延伸30 s。目的基因擴增 30個循環(huán)，最后 72℃5 min。

1.6.3 DNA電泳鑒定及圖像分析

應用Alpha Innotech FC2型凝膠圖像分析軟件進行條帶積分吸光度分析，用目的基因與β肌動蛋白基因條帶積分吸光度(integrated absorbance，IA)比值表示GnRH，GPR54和Kiss-1 mRNA的相對表達水平。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 大補陰丸對真性性早熟大鼠陰門開啟時間、子宮和卵巢臟器系數(shù)的影響

如表1所示，與正常對照組相比，大鼠處死之日，模型組6只大鼠陰門開啟數(shù)顯著增加(P＜0.01)，子宮系數(shù)顯著增加(P ＜0.05)，各組大鼠的卵巢系數(shù)差異不明顯;與模型組相比，大補陰丸3.24 g·kg－1組大鼠陰門開啟數(shù)顯著減少，子宮系數(shù)顯著降低(P＜0.05)。表明達那唑可促進大鼠子宮和卵巢提前發(fā)育，而大補陰丸3.24 g·kg－1組則可延緩子宮的提前發(fā)育。

2.2 大補陰丸對真性性早熟大鼠卵巢黃體數(shù)和子宮壁厚度的影響

如表2所示，模型組大鼠卵巢黃體數(shù)和子宮壁厚度與正常對照組相比均顯著增加(P＜0.01);大補陰丸3.24 g·kg－1組卵巢黃體數(shù)及大補陰丸3個劑量組子宮壁厚度與模型組相比均顯著減少(P＜0.05)，表明達那唑可明顯促進幼鼠子宮和卵巢等性器官的發(fā)育，大補陰丸具有延緩性早熟發(fā)育的作用。

Tab.1 Effect of Dabuyin Wan on vaginal opening，organ coefficients of uterus and ovary of precocious puberty rats

Tab.2 Effect of Dabuyin Wan on the incidence of corpora lutea and uterine wall thickness in precocious puberty rats

2.3 大補陰丸對真性性早熟大鼠下丘腦GnRH，Kiss-1和GPR54基因表達水平的影響

如圖1和表3所示，與正常對照組相比，模型組下丘腦GnRH，Kiss-1和GPR54基因表達均顯著增加(P ＜0.05);大補陰丸1.62和3.24 g·kg－1降低GnRH mRNA 的表達;而大補陰丸 3.24 g·kg－1降低Kiss-1 mRNA和GPR54 mRNA的表達。

Fig.1 Effect of Dabuyin Wan on mRNA expression of GnRH，Kiss-1 and GPR54 in precocious puberty rats.Lane 1:normal control;lane2:model;lane3:leuprorelin 100 μg·kg－1;lanes4 －6:Dabuyin Wan 3.24，1.62 and 0.81 g·kg－1，respectively.

Tab.3 Effect of Dabuyin Wan on gene expressions of gonadotropin releasing hormone(GnRH)，Kiss-1 and G protein-coupled receptor 54(GPR54)mRNA in hypothalamus of precocious puberty rats

3 討論

已有研究表明，滋陰瀉火合劑對性早熟下丘腦-垂體-性腺軸 (hypothalamic-pituitary-gonad axis，HPGA)功能的異常具有調節(jié)作用［3］。正常大鼠青春期啟動源于下丘腦GnRH脈沖式分泌的增加［6－7］，GnRH 作用于垂體前葉黃體生成素(luteinizing hormone，LH)和卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)分泌細胞上的GnRH受體，促進垂體LH和FSH的分泌，LH和FSH作用于性腺促使卵巢分泌雌二醇及睪丸分泌睪酮，從而促進生殖器官發(fā)育及第二性征的出現(xiàn)。本研究選擇以模型組大鼠陰門開啟數(shù)超過本組大鼠數(shù)的50%為實驗終點，實驗結果表明，模型組大鼠子宮系數(shù)、子宮壁厚度和卵巢黃體數(shù)分別為(154±14)個，(477±71)μm 和(3.1±0.3)個，表明模型組大鼠提前進入青春期。大補陰丸3.24 g·kg－1組子宮系數(shù)為 111 ±16，大補陰丸 0.81，1.62 和 3.24 g·kg－1組子宮壁厚度分別為166±27，237±22和(262±22)μm，黃體數(shù)均為0個，表明大補陰丸可明顯延緩大鼠青春期的啟動。

GnRH神經(jīng)元是機體整合了各種內外環(huán)境的刺激后，生殖內分泌體系的最終共同通路［8］。已有研究表明，GPR54是調控青春期發(fā)育的關鍵分子［9－10］，它的內源性配體是由 Kiss-1 基因編碼的Kiss神經(jīng)肽(Kisspeptin)。臨床流行病學和動物基因敲除實驗研究都發(fā)現(xiàn)，GPR54基因的功能缺失性突變或敲除，可導致人或小鼠發(fā)生以性發(fā)育不良、青春期啟動延遲甚至缺失為病理特征的原發(fā)性促性腺激素依賴性性腺功能減退癥［11］，提示Kiss-1/GPR54的表達與青春期發(fā)育密切相關。下丘腦Kiss-1的編碼產(chǎn)物Kisspeptin與其受體GPR54結合，刺激Gn-RH神經(jīng)元，使GnRH脈沖式分泌增加，從而導致生殖系統(tǒng)的發(fā)育。這種對于GnRH及其受體的降調節(jié)作用，可能是通過下調真性性早熟模型大鼠下丘腦Kiss-1基因表達來實現(xiàn)的，說明Kiss-1基因的轉錄和GnRH的合成與青春期啟動有著密切的關系，但這種降調節(jié)的趨勢卻不完全同步。因為生物基因遺傳信息的表達是通過轉錄、翻譯等一系列環(huán)節(jié)才能使生物體的生理功能得以體現(xiàn)，也就是說，在青春期發(fā)育的過程中，基因從轉錄到翻譯是需要一定過程的。雖然所檢測的Kiss-1，GnRH和GPR54 mRNA表達處于一個不同步的狀態(tài)，但結果都顯示了大補陰丸對大鼠下丘腦Kiss-1，GnRH和GPR54的降調節(jié)作用。

大補陰丸可通過下調下丘腦Kiss-1/GPR54 mRNA的表達，抑制GnRH mRNA及相關蛋白的表達，從而延緩下丘腦-垂體-性腺軸的啟動，達到治療真性性早熟的目的。性早熟發(fā)生的機制和大補陰丸對其治療作用較確切的機制尚待深入研究。

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