大黃酸對體外大鼠皮質神經元突起長度及微管相關蛋白2 mRNA表達的影響

鄢 黎，周曉雯，周 星，賴永長，羅煥敏，2，3

(暨南大學1.醫學院藥理學系，2.腦科學研究所，廣東廣州 510632;3.暨南大學-香港大學腦功能與健康聯合實驗室，廣東廣州 510632)

神經元的丟失、死亡以及神經網絡破壞近年來被認為是神經退行性疾病的重要病理學特征，例如帕金森病、阿爾茨海默病和亨廷頓病等［1］。在神經退行性疾病中，神經元及其突觸的丟失與神經營養因子(neurotrophic factors，NTF)的減少和缺失密切相關［2］。NTF是一類對中樞和周圍神經系統均具有營養活性的蛋白質或多肽，能促進神經細胞生長、發育、分化，維持其形態功能的完整性并提高其存活率［2-4］。但是由于其分子量過大難以通過血腦屏障，且易被降解和生物利用率低等弊端限制了這類物質的臨床應用［5］。

大黃酸屬單蒽醌類1，8-二羥基蒽醌衍生物，是從大黃、何首烏和虎杖等多種傳統中藥分離提純出的有效成分，具有抗菌、免疫抑制、利尿及抗炎等作用，并可用于治療糖尿病性腎病［6］;大黃酚具有改善 Aβ25～35致小鼠學習記憶障礙的作用［7］;大黃素能保護去卵巢大鼠并拮抗 Aβ對神經元的毒性作用［8］，提示大黃素有雌激素樣作用;大黃素甲醚的預處理對大鼠的局灶性腦缺血再灌注損傷具有神經保護作用［9］。大黃酸與大黃酚、大黃素和大黃素甲醚等的化學結構相近，研究RH的促進神經突起再生方面作用有利于進一步肯定蒽醌類結構在神經保護方面的作用，也有利于發現新的神經營養與保護類先導化合物，為結構改造提供母核。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

RH(純度＞98% 中國藥品生物制品檢定所);L-多聚賴氨酸，噻唑藍(MTT)，二甲基亞砜(DMSO)，LY294002，K252a ，Hoechst33258，焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)，單克隆兔抗大鼠神經元微管相關蛋白2(microtubule-associated protein 2，MAP2)(美國 Sigma公司);B27添加劑，DMEM/F12培養基 (美國Gibco公司);胎牛血清(美國Hyclone公司);胰蛋白酶(美國 Amresco公司);單克隆兔抗大鼠神經元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)IgG，即用型SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);Trizol(Introvengen公司);RT-PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司);SYBR Premix Ex TaqTM熒光定量試劑盒和150 bp DNA標志物(日本TaKaRa公司);溴化乙錠(ethidium bromide，EB)替代染料(北京普利萊基因技術有限公司)。

1.2 主要儀器

3K18冷凍高速離心機(美國 Sigma公司);Arium631純水儀(德國 Sartorius公司);AG梯度RT-PCR儀(美國 Eppendorf公司);450型酶標儀，Mini protean 3 cell電泳系統(美國Bio-Rad公司);Omega 10凝膠成像分析系統(美國 Ultra-Lum公司)。

1.3 細胞培養

24 h內的新生大鼠置于75%乙醇中消毒20 s，在超凈臺內將大腦皮質與嗅球和海馬分離開，并置于含有D-Hank液的青霉素瓶中。用眼科剪將其剪成1 mm3組織塊。用0.08%(W/V)的胰酶在37℃的培養箱中消化10 min。用DMEM/F12+10%FBS終止消化，再過濾離心收集細胞。用DMEM/F12將細胞混勻，并將細胞均勻地接種于用多聚賴氨酸0.1 g·L-1處理過的培養板上。采用無血清培養。

1.4 神經元的鑒定

1.4.1 NSE免疫細胞化學染色

將細胞接種于24孔板，培養72 h后用4%多聚甲醛固定20 min。用PBS 0.1 mol·L-1漂洗3次后加入純甲醇和30%H2O2(50∶1)室溫下浸泡20 min，PBS0.1 mol·L-1漂洗3 次后加一抗(抗NSE 1∶80)，室溫2 h;除去一抗用PBS 0.1 mol·L-1漂洗3次后加入辣根過氧化物酶標記單克隆兔抗大鼠NSE，室溫避光放置于濕盒內20 min，除去二抗用PBS漂洗2次滴加SABC，置于濕盒20 min，再用PBS漂洗加入DAB顯色，鏡下觀察并記錄結果。

1.4.2 MAP2 免疫熒光染色

將細胞接種于24孔板，培養72 h后用4%多聚甲醛固定20 min。用PBS0.1 mol·L-1漂洗3次后加入 0.1%TritonX-100 作用 10 min。PBS 0.1 mol·L-1漂洗3次后加一抗(抗MAP2 1∶200)，4℃過夜;除去一抗用PBS 0.1 mol·L-1漂洗3次后加入Cy3標記單克隆兔抗大鼠MAP2，室溫避光放置于濕盒內孵育1 h，除去二抗用PBS漂洗2次，熒光顯微鏡下觀察并記錄結果。

1.5 神經元平均突起長度測量

24孔板培養神經元，6 h細胞貼壁后加藥換培養基，實驗分為9組:溶媒對照組(0.1%DMSO)組，bFGF 10 μg·L-1組，RH 2，4 和 8 μmol·L-1組，K252a 50 nmol·L-1組，RH 8 μmol·L-1+K252a 50 nmol·L-1組，LY294002 10 μmol·L-1組，RH 8 μmol·L-1+LY294002 10 μmol·L-1組。作 用72 h，每孔隨機選取24個視野，每組4個復孔，拍照。以突起長度大于2倍胞體的神經元為陽性神經元，統計視野中的10個陽性神經元。采用Image Pro軟件計算照片中神經元的平均突起長度。

1.6 神經元存活率檢測

1.6.1 MTT 比色法

將大鼠皮質神經元接種于96孔板中，每孔3.3×104個細胞，6 h神經元貼壁后，換培養基加藥，實驗分為 5組:0.1%DMSO溶媒對照組;bFGF 10 μg·L-1組，RH 2，4 和 8 μmol·L-1組。培養72 h后，每孔加入20μl MTT 5 g·L-1，4 h后移去上清，加入 150μl DMSO，震蕩 10 min，用酶標儀上在570 nm波長下測各孔吸光度值(absorbance，A)，每組6個復孔，計算其平均值。細胞存活率(%)=(A實驗組-A對照組)/A對照組×100%。

1.6.2 LDH 測定

將大鼠皮質神經元接種于24孔板中，每孔2.5×105個細胞，6 h神經元貼壁后，換培養基加藥，按1.6.1項分組處理。取上清液，4℃，92×g離心1 min。按照LDH測定試劑盒說明書操作，用7600全自動生化儀測定LDH含量(U·L-1)。

1.7 RT-PCR測定神經元MAP2 mRNA含量

將大鼠皮質神經元接種于6孔板中，每孔1.0×106個細胞，貼壁后，換培養基加藥，實驗分為5組:溶媒對照組(0.1%DMSO)組，bFGF 10 μg·L-1組，RH 2，4和8μmol·L-1組。培養72 h后用Trizol提取大鼠皮質神經元總RNA，管家基因GAPDH作為內參基因。根據GenBank的序列(表1)，用Primer5.0軟件設計小鼠MAP2引物。PCR反應參數為:預變性94℃，30 s;變性 94℃，15 s;退火 58℃，15 s;延伸72℃，30 s;總循環數為35。用2%瓊脂糖凝膠在60 V，70 mA，1 h條件下對擴增好的PCR反應產物進行電泳，并用Multi Genius型凝膠成像分析系統進行圖像分析，對擴增DNA片段進行吸光度掃描，求出積分吸光度(integrated absorbance，IA)，計算MAP2基因與內參照基因GAPDH的IA比值表示mRNA的相對含量并拍攝照片。

Tab.1 Primer sequences of microtubule-associated protein 2(MAP2)and GAPDH

2 結果

2.1 培養的神經元形態學觀察與鑒定

從圖1A中可以看出細胞有明顯的突起，胞體呈圓形或梭形，在其周圍伴有明顯的光暈，胞核及核仁清晰可見。NSE免疫細胞化學鑒定(圖1B)和MAP2免疫熒光鑒定(圖1C)結果表明，95%以上的細胞呈陽性反應，故所培養的細胞大多數為神經元。

Fig.1 Immunocytochemical staining to identify cells in culture.A:the cultured neurons observed by inverted phase contrast microscope;B:the same neurons stained by NSE;C:these neurons stained further by MAP2 immunfluorescence.

2.2 大黃酸對神經元突起生長的影響

表2結果顯示，與溶媒對照組相比較，RH 2，4和8μmol·L-1組能明顯促進神經元突起生長，從(127±33)μm增加到(160±36)μm，具有統計學差異(P ＜0.01)。

Tab.2 Effect of RH on neurite length

與RH 8μmol·L-1組相比較，Trk受體拮抗劑K252a 50 nmol·L-1和 PI3K拮抗劑 LY294002 10μmol·L-1組神經元的平均突起長度均顯著性縮短，具有統計學差異(P＜0.01)。RH與K252a或與LY294002同時加入，RH延長神經元長度的作用被拮抗劑阻斷(P＜0.01)，基本恢復至溶媒對照組水平(表3，表4)。

Tab.3 Effect of RH with K252a on neurite length

Tab.4 Effect of RH with LY294002 on neurite length

2.3 大黃酸對神經元存活率的影響

MTT結果(表5)表明，與溶媒對照組相比，RH 2，4和8μmol·L-1組細胞的存活率均明顯增加。A值從0.089 ±0.002增加到 0.100 ±0.005，存活率增加到(115.7±2.5)%具有顯著意義(P ＜0.05)。bFGF 10μg·L-1組細胞存活率明顯增高，達(178.7 ±8.0)%。

神經細胞衰老或受損時會導致生物膜功能異常，LDH的滲漏量增加，因此，培養液中LDH的活性可反映神經細胞的生長和存活狀態。LDH檢測結果(表6)顯示，與溶媒對照組相比，RH 2，4和8 μmol·L-1組神經元中LDH含量均顯著降低(P＜0.05)，最低達 (7.50 ±0.58)U · L-1;bFGF 10μg·L-1組神經元中LDH含量也明顯降低(P＜0.01)，達到(7.25 ±1.26)U·L-1。

Tab.5 Effect of RH on neurons survival rate by MTT assay

Tab.6 Effect of RH on neurons survival rate by LDH release assay

2.4 大黃酸對大鼠皮質神經元MAP2 mRNA表達的影響

RT-PCR結果(圖2和表7)表明，與溶媒對照組比較，RH 2μmol·L-1組 MAP2 mRNA 無明顯改變，RH 4和8μmol·L-1顯著增加皮質神經元中MAP2 mRNA表達(P＜0.05)，作用效果與陽性對照藥bFGF 10μg·L-1相當。說明RH可以增強大腦皮質神經元MAP2 mRNA表達能力。

Fig.2 Effect of RH on microtubule-associated protein 2 mRNA(MAP2 mRNA)expression in cortical neurons of rats.Lane 1:0.1%DMSO;lane 2:bFGF 10 μg·L-1;lanes 3-5:RH 2，4 and 8 mmol·L-1 .

Tab.7 Effect of RH on MAP2 mRNA expression

3 討論

神經元體外培養模型是神經元發育分化、神經再生、神經疾病的發生機制藥物篩選等眾多研究領域的重要模型。體外培養神經元的方法總體可分為有血清培養和無血清培養。血清可以提供細胞生長所需要的各種營養物質，當培養基中去除血清后，神經元存活率會大大降低［10］。但由于血清成分復雜，對實驗結果影響干擾較大。而無血清培養步驟簡便，培養的細胞活性及生理特性保持良好。故本實驗選用無血清培養模型，探討RH對神經元突起生長及神經元存活率的影響。

提高神經元的存活率和促進突起生長是考察被篩選的藥物在體外實驗中是否具有神經營養作用的主要指標。本實驗形態學結果表明，RH與溶媒對照組比較能顯著增長神經元突起長度，MAP2屬于結構性相關蛋白家族，主要存在于中樞神經元的樹突和胞體［11］，在維持神經元形態方面起著重要的作用，并能調控突起的生長和可塑性［12］。RT-PCR結果表明，RH促進MAP2 mRNA表達，說明RH能促進神經元突起的生長，維持其形態的穩定。MTT比色法和LDH檢測結果顯示，與溶媒對照組相比，RH各濃度組均可以提高細胞活力，使神經元的存活率提高。以上結果提示，RH兼有促進神經元突起生長和促進細胞存活的雙重作用，與神經營養因子的作用類似。具有潛在的治療神經退行性疾病及其相關疾病的作用。

目前一般認為，小分子神經營養擬似物可通過直接激活Trk受體、間接激活Trk受體(有些物質可能通過腺苷A2a受體活化間接激活Trk受體)、促進NTF與Trk受體結合以及誘導神經營養素的表達或分泌等途徑發揮作用。本實驗中，工具藥K252a(Trk受體抑制劑)能部分阻斷RH的作用，表明RH可能是部分通過Trk受體產生作用。

NTF主要通過激活Ras/PI3K/PKB途徑，促進神經元存活，抑制其凋亡，從而起到神經保護作用的［14］。本實驗中，加入LY294002后，RH的作用被完全阻斷，暗示RH可能主要通過PI3K這一信號通路產生神經營養作用。后續實驗將運用Western印跡技術檢測PI3K等下游相關蛋白的磷酸化水平，從而進一步確證RH的作用機制是否是通過激活Ras/PI3k/PKB通路而發揮作用的。

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