CD 20嵌合抗體的構建、表達及純化的實驗研究

梁碧華 李潤祥 馬少吟 龔業青 李薇 畢超 朱慧蘭 廣東省廣州市皮膚病防治所，廣東廣州 510095

CD 20嵌合抗體的構建、表達及純化的實驗研究

梁碧華 李潤祥 馬少吟 龔業青 李薇 畢超 朱慧蘭 廣東省廣州市皮膚病防治所，廣東廣州 510095

目的構建CD20嵌合抗體，檢測其活性并純化該嵌合抗體。方法從雜交瘤細胞株中分別擴增抗鼠CD20抗體的輕鏈和重鏈基因的可變區，并與人的輕鏈和重鏈恒定區連接，分別克隆到pTY5真核表達載體，然后共轉染293E細胞，通過RT-PCR檢測mRNA的轉錄，夾心ELISA檢測抗體表達量，流式細胞術（FCM）分析嵌合抗體的結合特異性。結果正確擴增得到抗CD20人鼠嵌合抗體的輕鏈和重鏈基因片段并成功構建重組真核表達載體pTY5-CD20H和pTY5-CD20L，在293E細胞中進行瞬時表達，RT-PCR顯示抗體基因在細胞中進行了成功的轉錄，ELISA測定抗體表達量在15～24 ng/mL之間，流式檢測結果證實細胞上清分泌的抗CD20嵌合抗體可與NS-1細胞株結合，并通過protein A柱親和層析獲取高純度的抗CD20嵌合抗體。結論成功構建表達抗CD20嵌合抗體的載體，且表達的抗體具有結合活性，為下一步研究慢性蕁麻疹的發病機制及治療打下基礎。

CD20；嵌合抗體；慢性蕁麻疹；自身免疫疾病

CD20抗原是一種B細胞分化抗原，僅位于前B細胞和成熟B細胞，而在造血干細胞、血漿細胞和其他正常組織中不表達[1]，是B細胞靶向治療的理想作用位點?？笴D20單克隆抗體（mAb）以B細胞表面分子CD20為靶向，其用于治療B細胞淋巴瘤已經獲得了令人鼓舞的療效[2]。近年來也越來越多地應用到自身免疫性疾病的治療，包括慢性蕁麻疹（chronic urticaria，CU）的治療[3]。

慢性蕁麻疹是一種常見皮膚病，目前治療效果不佳，且其發病機制較為復雜，至今尚未完全清楚[4-8]。雖有研究表明將B細胞靶向治療應用于慢性蕁麻疹具有良好療效[9-11]，但目前資料有限，對于具體的作用機制尚不清楚。為了尋找更為有效安全的用于治療慢性蕁麻疹的CD20抗體藥物，本研究在前期篩選獲取抗CD20單克隆細胞株的基礎上，擬克隆其重鏈和輕鏈的基因片段，構建重組真核表達載體，并最終表達、純化具有細胞結合活性的抗CD20嵌合抗體，為下一步治療慢性蕁麻疹的研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

雜交瘤細胞株、TOP10（大腸埃希菌）、293E細胞、NS-1細胞為本實驗室保存。

RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒購自美國Promega公司；質粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購于康為世紀公司；DNA連接酶、限制性內切酶、Ex Taq酶、DNA Marker購于大連寶生物公司；轉染試劑Lipofectamine 2000、RPMI 1640培養基、DMEM培養基購自Invitrogen公司；改良型快速雜交瘤細胞培養基購自PAA公司；FITC標記的羊抗小鼠IgG抗體購自美國Santa Cruz公司；protein A層析柱購自杭州賢至生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設計參考文獻報道[12-13]設計合成針對鼠輕、重鏈可變區序列的引物；根據Genebank檢索得到的抗體κ和IgG1型基因序列設計合成針對輕、重鏈恒定區的引物，見表1。

表1 PCR引物

1.2.2 細胞培養雜交瘤細胞培養于改良型快速雜交瘤細胞培養基中；293E細胞培養于DMEM培養基中，NS-1細胞培養于RPMI 1640培養基中，均含10%胎牛血清和雙抗；培養于5%CO2、37℃培養箱中。

1.2.3 RNA提取與cDNA合成分別收集雜交瘤細胞和293E細胞，按TRIZOL的說明書進行提取細胞總RNA，測OD值和電泳檢測RNA質量，按RT-PCR試劑盒說明書進行逆轉錄得cDNA，保存于-20℃備用。

1.2.4 抗體輕、重鏈基因的調取與克隆以來源于雜交瘤細胞的cDNA為模板，用引物VL-F和VL-R、VH-F和VH-R分別擴增輕、重鏈可變區基因；以來源于293E細胞的cDNA為模板，用引物CL-F和CL-R、CH-F和CH-R分別擴增輕、重鏈恒定區基因。上述序列測序驗證正確后，通過重疊延伸PCR，連接可變區和恒定區，得到完整抗體基因。再次測序驗證，然后將輕、重鏈基因用內切酶Eco RI、Bam HI分別進行雙酶切，分別克隆到用同樣酶進行雙酶切的載體pTY5中。連接產物轉化TOP10感受態細胞，于平板（氨芐抗性）37℃過夜培養后，分別挑取單克隆菌株鑒定測序。構建好的重組表達載體分別命名為pTY5-CD20H和pTY5-CD20L。

1.2.5 轉染和鑒定轉染前1天接種細胞：用胰酶消化293E細胞后，調細胞濃度為2.5×105個/mL，每孔1.0mL接種24孔板，置37℃含5%CO2培養箱培養至細胞貼壁生長達到底面積70%。轉染按Lipofectamine 2000說明書進行，質粒轉染量為1μg，培養4 h后更換DMEM培養液，繼續培養48 h，然后收集細胞提取RNA，進行逆轉錄，PCR鑒定抗體基因轉錄情況。

1.2.6 蛋白表達純化及初步測定質粒轉染293E細胞，搖瓶培養，4～7 d收獲培養基上清，ProteinA柱純化抗體。操作方法參照說明書進行，純化后用分光光度計測OD值推算濃度，以SDA-PAGE測定蛋白的純度、分子量。

1.2.7 嵌合抗體表達的ELISA檢測以羊抗人κ多抗于4℃包被酶標板過夜，用含1%BSA的PBST在37℃進行封閉2 h。分別加入嵌合抗體的表達上清和空質粒轉染的上清，以人IgG參考品作為陽性對照。37℃孵育30min后用PBST洗5次，再加入HRP標記的羊抗人Fc抗體，37℃孵育30 min后用PBST洗5次。再加入TMB顯色，酶標儀讀取450 cm及630 cm雙波長讀數。

1.2.8 流式細胞術檢測抗體結合活性收集NS-1細胞，每管5×105個，用PBS洗1遍，離心收集細胞；各管加表達抗體，室溫反應1 h，設置陰性對照；離心收集細胞，用PBS洗1遍，加二抗FITC-羊抗小鼠IgG（1∶500），室溫避光反應1 h；離心收集細胞，用PBS洗1遍，各管用300μL PBS重懸，上機檢測。

2 結果

2.1 抗體基因的克隆

PCR結果見圖1，擴增大小正確，測序驗證后，序列顯示為抗體基因?？寺〉奖磉_載體后，雙酶切鑒定無誤，結果見圖2。測序結果顯示，所克隆片段為鼠輕鏈可變區加人輕鏈恒定區，所調取抗體恒定區輕鏈為κ型；另一片段為鼠重鏈可變區加人重鏈恒定區，所調取抗體恒定區重鏈為IgG1型。

2.2 抗體基因的表達鑒定

將克隆有抗體輕、重鏈基因的表達載體同時轉染進293E細胞，然后收集細胞提取RNA，進行逆轉錄后用特異的引物進行PCR鑒定。PCR結果顯示能特異擴增目的片段，見圖3。這說明攜帶抗體輕、重鏈基因的表達載體成功轉染進293E細胞，并能表達抗體基因。

2.3 表達蛋白的純化和測定

收集上清約180mL進行純化，純化后體積為2.7mL。根據分光光度計所測OD值估算蛋白濃度為200μg/mL左右。用protein A柱能純化出蛋白，即說明此蛋白能與protein A親和柱結果，可判定其為抗體類物質。在還原條件下的SDSPAGE結果請見圖4，顯示有2條帶，分子量約為23 kDa和51 kDa，與本研究設計的輕重鏈分子量相符合，表明成功獲得了蛋白質為IgG1型的完整抗體分子。

2.4 抗體ELISA含量的測定

轉染3 d后，夾心ELISA測定上清中嵌合抗體的含量，通過與陽性參考品比較，上清中抗體的含量在15～24 ng/mL之間。

2.5 表達抗體的結合活性

流式檢測結果請見圖5，結果表明共轉染了嵌合基因的細胞培養上清能與NS-1細胞結合，具有親本鼠源抗體結合效果。這表明所表達的嵌臺抗體具有正確的抗原結合特性，并且含有人抗體恒定區序列。

3 討論

慢性蕁麻疹病因多樣復雜，發病機制不清楚，治療相對比較困難，嚴重影響了患者的生活質量[4-8]。目前治療慢性蕁麻疹的藥物很多，但療效不佳[14-15]。目前已有研究表明抗CD20單克隆抗體治療慢性蕁麻疹具有良好療效[9-11]，但具體作用機制還有待研究。

CD20是非糖基化的Ⅲ型跨膜蛋白，具有高度保守性，位于B淋巴細胞表面，是B淋巴細胞表面分化抗原[16]。它主要參與調節B淋巴細胞的增殖與分化，在免疫系統起重要作用。而B細胞在蕁麻疹的發病中起著關鍵作用，抗CD20單克隆抗體通過靶向治療而清除B細胞，可能通過干擾B細胞所發揮的功能而達到免疫抑制作用，從而緩解蕁麻疹癥狀[3]。Arkwright[9]首次報道利用利妥昔單抗成功治療嚴重慢性自身免疫性蕁麻疹1例，不過其報道同時認為此單抗可能不適用于物理性蕁麻疹患者的治療。Mukhtyar等[10]也報道成功治療1例難治性蕁麻疹性血管炎。而Murota等[11]報道1例Schnitzler綜合征并發B細胞淋巴瘤患者在接受利妥昔單抗和放射療法聯合治療后，在淋巴瘤癥狀改善后蕁麻疹癥狀也逐步得到改善。這些研究均提示B細胞在蕁麻疹發病中的重要作用，但更深入的研究還有待進行。

與鼠抗相比，嵌合抗體既保留了鼠源可變區的高親和性，又具有人Fc段的多種免疫殺傷功能，降低了人抗鼠抗體反應的發生率，改善了臨床治療效果[17-18]。與其他小分子基因工程抗體相比，嵌合抗體作為完整抗體分子，在體內半壽期更長，并具有人Fc段的多種免疫殺傷功能[19-20]。本研究成功構建了含鼠源可變區和人源恒定區的抗體基因，在293E細胞中進行瞬時表達后，RT-PCR顯示抗體基因在細胞中進行了成功的轉錄，ELISA測定抗體表達量在15～24 ng/mL之間，流式檢測結果證實細胞上清分泌的抗CD20嵌合抗體可與NS-1細胞株結合，并通過protein A柱親和層析獲取高純度的抗CD20嵌合抗體，可用于進一步研究抗抗CD20單克隆抗體治療慢性蕁麻疹的療效和機制的實驗。

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Experimental study of construction,expression,and purification of CD20 chimeric antibody

LIANG Bihua LIRunxiang MA Shaoyin GONG Yeqing LIWei BIChao ZHU Huilan
Guangzhou Institute of Dermatology,Guangdong Province,Guangzhou 510095,China

ObjectiveTo construct CD20 chimeric antibody and test its activity and purify it.MethodsLight chain gene's and heavy chain gene's variable regions from rat anti-CD20 antibody were amplified from hybridoma cell strains respectively,and were connected with invariable regions of human's light chain and heavy chain.After that,they were cloned to pTY5 eukaryotic expression vector,and then to transfection of 293E cell.Transcription ofmRNA,antibody expression,and binding specificity of chimeric antibody were tested by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)and sandwich enzyme-linked immuno sorbent assay(ELISA),and analyzed by flow cytometry(FCM)correspondingly.ResultsLight chain gene segment and heavy chain gene segment of human-rat chimeric antibody from CD20 antibody were correctly amplified,which also successfully constructed recombination eukaryotic expression vectors of pTY5-CD20H and pTY5-CD20L who could express instantaneously in 293E cell.RT-PCR revealed antibody gene′s transcription in cellswas successful.Through ELISA determination,quantity of antibody expression was between 15-24 ng/mL.Flow cytometry confirmed that anti-CD20 chimeric antibody from secretion of supernatant could bind with NS-1 cell strain.High purity of anti-CD20 chimeric antibody could be obtained through protein A column affinity chromatography.ConclusionSuccessful construction of expression anti-CD20 chimeric antibody's vector and expressed antibody with bound activity lay a foundation for next study of pathogenesis and treatmentof chronic urticaria.

CD20;Chimeric antibody;Chronic urticaria;Autoimmune disease

R593

A

1673-7210（2012）11（b）-0010-04

廣東省廣州市科技支撐計劃項目（項目編號：2009Z1-E011）。

朱慧蘭（1966.9-），女，中共黨員，主任醫師，碩士生導師，廣州市衛生局局管優秀科技人才，現任廣州市皮膚病防治所副所長，主要從事皮膚病方面的研究。

2012-04-25 本文編輯：衛軻）