大鼠針刺置高臺固定方法

王宇,寧友,2,王培育,3,楊永清

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所分子生物學(xué)(針灸)實驗室,上海 200030;2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究所,上海 200040;3.河南中醫(yī)學(xué)院,鄭州 450008)

大鼠是在針刺機理實驗中被經(jīng)常使用的動物。常用的大鼠固定方法有捆綁固定、器械固定、手部抓取固定等[1]。目前國內(nèi)外普遍采用的針刺大鼠固定方法為束縛固定法,包括狹小空間固定與捆綁固定。但是束縛固定會引起大鼠束縛應(yīng)激效應(yīng),與針刺效應(yīng)疊加,嚴重干擾了針刺效應(yīng)的客觀分析。因此,如何在針刺時,選擇適宜的大鼠固定方法,盡量減少應(yīng)激效應(yīng)對針刺效應(yīng)的干擾,是針灸研究中所面臨的關(guān)鍵問題之一。

為此,我們利用大鼠具有畏高的特性,設(shè)計了大鼠置高臺的固定方法。以大鼠1型糖尿病模型為實驗對象,觀察束縛固定與置高臺固定下針刺對糖尿病大鼠血糖的影響。結(jié)果表明,與束縛固定方法相比,置高臺固定法對大鼠糖尿病模型血糖影響效小,是一種適合的大鼠針刺固定方法。

1 材料與方法

1.1 動物分組

健康雄性SD大鼠,CL級,購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心,體重(220±10)g,36只,根據(jù)計算機隨機數(shù)字分為6組,每組6只。正常組(Normal)采取普食,不做任何處理;1型糖尿病模型組(DM)采取普食,1型糖尿病模型制作;1型糖尿病模型-束縛固定組(DM-Binded)采取普食,1型糖尿病模型制作,每天束縛固定30 min;1型糖尿病模型-束縛固定-針刺組(DM-Bin-Acu)采取普食,1型糖尿病模型制作,每天束縛固定30 min,同時針刺干預(yù);1型糖尿病模型-置高臺固定組(DM-Elevated)采取普食,1型糖尿病模型制作,每天置高臺固定30 min;1型糖尿病模型-置高臺固定-針刺組(DM-Ele-Acu)采取普食,1型糖尿病模型制作,每天置高臺固定30 min,同時針刺干預(yù)。

1.2 儀器設(shè)備、材料與試劑

0.30 mm×15 mm針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司出品的華佗牌無菌針灸針);羅氏 ACCU-CHEK Advantage血糖儀(羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司)。

鏈脲佐霉素(Streptozotocin,STZ,A.R.,Sigma)、檸檬酸(Citric acid monohydrate,A.R.,上海化學(xué)試劑有限公司)、檸檬酸三鈉(Trisodium citrate dehydrate,A.R.,上?；瘜W(xué)試劑有限公司)、羅氏ACCU-CHEK AdvantageⅡ血糖試紙(羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司)。

1.3 大鼠1型糖尿病模型造模方法

大鼠1型糖尿病模型造模方法[2,3],SD大鼠被置于模擬晝夜變化(12 h白天,12 h黑夜)的清潔室內(nèi),溫度 20℃～23℃,濕度為 50%,所有動物造模前一天禁食過夜8 h。將STZ溶解在0.1 mol/L,檸檬酸三鈉-檸檬酸緩沖液中(pH 4.2),配制成 1%STZ溶液,其中檸檬酸三鈉-檸檬酸緩沖液是由0.1 mol/L檸檬酸三鈉母液和0.1 mol/L檸檬酸母液按1:1.32體積配制。按照 60 mg/kg劑量,一次性腹腔注射 STZ溶液,誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型。

1.4 大鼠置高臺固定方法

將大鼠放置于木制高臺踏板(6 cm×12 cm)上,距地面50 cm(見圖1、2),每天1次,每次30 min。

圖1 大鼠針刺置高臺固定照片

圖2 木制高臺設(shè)計側(cè)面圖(左)與俯視圖(右)

1.5 大鼠束縛固定方法

大鼠腹部向下,四肢用醫(yī)用膠布粘縛于木板上,胸部用 1 cm寬皮帶固定,防止逃脫。每日 1次,每次30 min。

1.6 針刺方法

取肝俞、脾俞、腎俞[4]。肝俞位于第 9胸椎下旁開5 mm之兩旁肋間;脾俞位于第12胸椎下旁開5 mm之兩旁肋間;腎俞位于第2腰椎下旁開5 mm之兩旁肋間[5]。針刺方法采用直刺 6 mm,行平補平瀉,每 5 min行針1次(以200次/min捻轉(zhuǎn)速度,左右捻針20次為行針1次),留針20 min。隔日針刺1次,共4次。

1.7 大鼠血糖檢測方法

采用尾靜脈采血法,用鋒利刀片在尾靜脈上切開小口,取少量血液,用羅氏ACCU-CHEK Advantage血糖儀測定血糖濃度并記錄。測定時間安排在STZ注射前第8、1天和STZ注射后第1、2、3、5、7、9、11、13、15天,共11次,測定的時間安排在下午進行,兩側(cè)尾靜脈可交替切割,切割后用棉球壓迫止血。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

本實驗采用血糖濃度參數(shù)評價1型糖尿病模型。多組比較用單因素方差(One-Way ANOVA)分析,組間析因分析用LSD檢驗,檢驗水準=0.05。兩組比較用獨立樣本t檢驗,檢驗水準=0.05。

束縛固定與置高臺固定下,針刺對DM大鼠血糖的平均影響率分析方法為非針刺組血糖均值(GLU1)與針刺組血糖均值(GLU2)的差值(GLUΔ)除以DM組血糖均值(GLU0),即為針刺對血糖的平均影響率(I),計算公式為 I=(GLU1-GLU2)/GLU0×100%。

2 結(jié)果

圖3-A可見,正常大鼠血糖值穩(wěn)定。糖尿病模型組大鼠自造模第1天起,血糖水平逐漸增高,與正常大鼠比較,自造模第1天至第15天內(nèi),具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.000)。糖尿病模型-束縛組血糖與糖尿病模型組比較,存在明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。表明束縛固定可明顯降低糖尿病模型的血糖水平。糖尿病模型-置高臺組血糖與糖尿病模型組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。表明置高臺雖然可以引起糖尿病模型大鼠血糖水平的變化,但無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3-B可見,與模型組比較,置高臺針刺可明顯降低糖尿病模型大鼠血糖水平(P＜0.05)。與糖尿病模型-置高臺組比較,置高臺針刺同樣可明顯降低糖尿病模型大鼠血糖水平(P＜0.05)。表明去除置高臺的本底效應(yīng),針刺依然對糖尿病大鼠血糖具有明顯下調(diào)作用,針刺的效應(yīng)得到明顯體現(xiàn)。

圖3-C可見,束縛固定可明顯降低糖尿病模型的血糖水平(P＜0.05)。糖尿病模型-束縛-針刺組血糖與糖尿病模型組比較,也存在明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05),但與糖尿病模型-束縛組比較無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。表明束縛應(yīng)激效應(yīng)顯著,在此效應(yīng)基礎(chǔ)止,針刺本身的效應(yīng)難以體現(xiàn)。

圖3-D可見,與糖尿病模型組相比,雖然束縛-針刺與置高臺-針刺均可明顯下調(diào)血糖水平(P＜0.05),但糖尿病模型-束縛-針刺組與糖尿病模型-置高臺-針刺組相比,兩組血糖水平差異不明顯(P＞0.05)。

圖3 束縛固定與置高臺固定下針刺對糖尿病大鼠血糖的影響

在束縛固定與置高臺固定下,針刺對糖尿病大鼠血糖的平均影響率分析,如圖 4所示,糖尿病模型-束縛-針刺組對糖尿病模型的血糖平均影響率為 12%(1%～15%),在造模第1天最大,第2天最小;而糖尿病模型-置高臺-針刺組對糖尿病模型的血糖平均影響率為 52%(39%～74%),在造模第 1～3天較大。兩者對大鼠血糖的平均影響率差異顯著(P＜0.05)。進一步顯示在不同固定條件下,針刺對糖尿病模型大鼠血糖的影響效果不同,置高臺情況下,針刺對糖尿病模型大鼠血糖的影響效應(yīng)得到明顯體現(xiàn)。

3 討論

圖4 束縛固定與置高臺固定下,針刺對糖尿病大鼠血糖平均影響率的比較

應(yīng)激是指機體內(nèi)在的動態(tài)平衡狀態(tài)被打破后所出現(xiàn)的全身性非特異性適應(yīng)反應(yīng)過程。應(yīng)激反應(yīng)以機體受到內(nèi)外環(huán)境刺激后產(chǎn)生下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸及交感腎上腺髓質(zhì)活性增強為特征[6]。應(yīng)激會干擾機體已有的平衡,引起機體的反饋與負反饋效應(yīng),產(chǎn)生損傷或保護作用,影響生理與病理反應(yīng)。針刺效應(yīng)是機體的自我調(diào)控的結(jié)果,因此在應(yīng)激背景下進行針灸效應(yīng)研究,必然導(dǎo)致應(yīng)激效應(yīng)與針刺效應(yīng)的疊加,將會干擾對針灸效應(yīng)的研究。目前在針刺機理實驗中普遍采用的大鼠針刺固定方法為束縛固定法。但是束縛固定會引起大鼠束縛應(yīng)激效應(yīng)。我們利用大鼠具有畏高的特性,設(shè)計了大鼠針刺置高臺的固定方法,以盡量減少應(yīng)激效應(yīng)對針刺效應(yīng)的干擾。

本文結(jié)果顯示,糖尿病模型-束縛固定、糖尿病模型-束縛-針刺均能明顯降低糖尿病模型的血糖水平,兩者之間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異,表明束縛應(yīng)激效應(yīng)顯著,在此效應(yīng)基礎(chǔ)止,針刺本身的效應(yīng)難以體現(xiàn)。糖尿病模型-置高臺組血糖與糖尿病模型組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。與糖尿病模型組和糖尿病模型-置高臺組相比較,糖尿病模型-置高臺-針刺均可明顯降低糖尿病模型大鼠血糖水平,表明去除置高臺的本底效應(yīng),針刺依然對糖尿病大鼠血糖具有明顯下調(diào)作用,針刺的效應(yīng)得到明顯體現(xiàn)。盡管糖尿病模型-束縛-針刺組與糖尿病模型-置高臺-針刺組相比,兩組血糖水平差異不明顯,但在束縛固定與置高臺固定下,針刺對糖尿病大鼠血糖的影響率分析結(jié)果顯示,糖尿病模型-束縛-針刺組對糖尿病模型的血糖平均影響率為 12%,而糖尿病模型-置高臺-針刺組對糖尿病模型的血糖平均影響率為 52%,二者存在明顯統(tǒng)計學(xué)差異,進一步顯示置高臺情況下,針刺對糖尿病模型大鼠血糖的影響效應(yīng)得到明顯體現(xiàn)。

有文獻報道將大鼠置于高臺可誘發(fā)急、慢性應(yīng)激,引起血漿中皮質(zhì)酮水平和海馬中乙酰膽堿升高[7]。本文數(shù)據(jù)顯示,置高臺雖然能引起糖尿病大鼠模型血糖水平的變化,但無統(tǒng)計學(xué)意義,說明置高臺固定對血糖的影響很有限?？赡芴崾?大鼠針刺置高臺固定方法,更適用于非應(yīng)激性疾病的研究。

因大鼠置高臺時自然體位處于趴臥位,因此該固定方法較適合于選取大鼠頭背部、四肢外側(cè)的穴位進行針刺。如需針刺大鼠腹側(cè)面以及四肢內(nèi)側(cè)面的穴位,尚需在此基礎(chǔ)上探索更理想的大鼠固定方法。

參考文獻

[1]劉恩岐,尹海林,薛智謀,等.醫(yī)學(xué)實驗動物學(xué)[M].第 3版,北京:人民衛(wèi)生出版社,2004:123.

[2]沈偉,范淑允,陳曉雯.糖尿病實驗動物模型建立及中醫(yī)實驗研究進展[J].中醫(yī)藥臨床雜志,2007,19(6):628-630.

[3]Rossini AA, Williams RM, Appel MC, et a1. Sex difference in the multiple-dose streptozotocin model of diabetes[J]. Endocrinology, 1978,103(4):1518-1520.

[4]諶劍飛,魏稼.針灸治療糖尿病50年重大進展概述[J].中國針灸,2001,21(5):315-318.

[5]李忠仁.實驗針灸學(xué)[M].第 1版,北京:中國中醫(yī)藥出版社,2003:327.

[6]Chrousos GP. Stress and disorders of the stress system[J]. Nat Rev Endocrinol, 2009,5(7):374-381.

[7]Degroot A, Wade M, Salhoff C, et a1. Exposure to an elevated platform increases plasma corticosterone and hippocampal acetylcholine in the rat: reversal by chlordiazepoxide[J]. Eur J Pharmacol, 2004,493(1-3):103-109.