電針胃俞募穴對大鼠胃運動及延髓DVC區(qū)c-fos表達的影響

申國明,王浩,秦勇

(安徽中醫(yī)學院中西醫(yī)結(jié)合臨床學院,合肥 230038)

近年來, 國內(nèi)外許多學者對高位中樞核團在胃運動調(diào)節(jié)中的作用進行了大量研究[1-3]。現(xiàn)已證明,中樞的某些部位及核團參與了針刺對胃運動和胃電活動的調(diào)節(jié)。但高位中樞是否參與電針胃俞募穴對胃運動的調(diào)節(jié)尚未見報道。我們利用電針刺激大鼠胃俞募穴,并設(shè)立空白對照組,通過觀察 c-fos在與胃運動密切相關(guān)的中樞延髓 DVC中的表達,探討電針胃俞募穴對胃運動作用的中樞作用靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年SD大鼠,雌雄各半,體重220～250 g,購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心(No.0001305)。置于室溫(25±2)℃,12/12 h晝夜循環(huán)光照條件下生活,自由攝食、飲水。

1.2 主要實驗設(shè)備

Biopac多導生理記錄儀及Acqknowledge軟件分析系統(tǒng)(美國 BIOPAC公司),CS-Ⅵ型攤片烤片機、LeicaRM2016切片機、TS-12A生物組織自動脫水機、BM-Ⅸ生物組織包埋機(湖北省孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司),DHG-924385-Ⅲ電熱恒溫鼓風干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司),日本OLYMPUS生物顯微鏡等。

1.3 實驗器械及主要試劑

華佗牌 SDZ-Ⅳ型電子針療儀、針灸針,均由蘇州醫(yī)療用品廠有限公司提供;電阻應變片,由中國航天空氣動力研究所提供;SABC免疫組化試劑盒、兔抗 Fos多克隆抗體等,均由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.4 動物分組及應力傳感器的埋置

選擇健康SD大鼠32只,稱重記錄后,隨機分為空白對照組(空白組)、針刺中脘組(中脘組)、針刺胃俞組(胃俞組)、針刺中脘配胃俞組(中脘＋胃俞組),每組8只。同等條件下飼養(yǎng)。適應性飼養(yǎng)1星期后,禁食12 h,自由飲水,用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉,消毒條件下開腹,暴露胃體,距幽門0.3 cm處沿環(huán)形肌方向?qū)⒆灾茟鞲衅骺p貼于胃竇腹側(cè)面漿膜,導線經(jīng)皮下引至頸部固定。

1.5 取穴及針刺方法

根據(jù)華興幫《大鼠穴位圖譜》和體表的骨性標志,胃俞取第十三胸椎下旁開5 mm,毫針直刺4～6 mm;中脘取臍上約20 mm,毫針直刺2 mm,采用平補平瀉手法。至針下出現(xiàn)沉緊感時,接 SDZ-Ⅳ型電子針療儀,電壓9 V,疏密波型,頻率20～100 Hz混頻刺激,電針左側(cè)胃俞、中脘,強度以局部皮膚肌肉輕微顫動為度。治療時間20 min,每日治療1次,連續(xù)治療7 d。

1.6 觀察指標及方法

針刺 1星期后,記錄各組大鼠胃運動,記錄完畢,10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉,快速剪開胸廓,捏住心臟,于心尖處剪一小口,插入灌注針頭到主動脈,止血鉗固定,剪開右心耳,快速滴入氯化鈉150 mL,再注入4%多聚甲醛300 mL,取腦,浸入固定液中,4℃放置48 h,脫水、包埋、切片。觀察DVC區(qū)c-fos表達情況。

1.6.1 胃運動的記錄

大鼠禁食 12 h,自由飲水。將清醒動物置于特制鼠籠內(nèi),應力傳感器導線接于Biopac多導生理記錄儀,通過生物信號記錄系統(tǒng)記錄胃運動(胃運動量程1 mv、濾波20 Hz)。應用Acqknowledge軟件分析系統(tǒng),取胃運動幅度的平均值及頻率作為觀察指標。

1.6.2 免疫組化染色

切片脫蠟至水,3%H2O2室溫孵育滅活內(nèi)源性酶,PBS液沖洗3次,熱修復抗原,自然冷卻;滴加5%BSA封閉液,室溫孵育 20 min;甩去多余液體,滴加 1:300稀釋度的兔抗c-fos(一抗),4℃過夜;室溫放置1 j,滴加生物素化山羊抗小鼠IgG(二抗),37℃孵育20 min后PBS沖洗 3次;甩去 PBS液滴加試劑 SABC,37℃孵育20 min后PBS沖洗4次;甩去PBS滴加新鮮配制的DAB液,顯微鏡下觀察 5 min,適時終止反應。蘇木素輕度復染,脫水,透明,封片,顯微鏡觀察,以胞漿或胞核有棕色顆粒者為陽性細胞。參考大鼠腦立體定位圖譜[4],在低倍鏡下明確DVC區(qū),在400倍光鏡下選取DVC區(qū)視野攝像,用Image-Pro Plus 5.1圖像處理與分析系統(tǒng)分析所選視野的表達強度(積分光密度)。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 電針對大鼠胃運動的影響

空白組和各電針組大鼠胃運動收縮波以胃運動幅度的平均值及頻率作為觀察指標(詳見圖 1)。由表 1可見,電針各組胃竇運動幅度明顯增加,與空白組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);且中脘＋胃俞組胃運動幅度增加更為顯著,與中脘組和胃俞組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。電針對各組大鼠胃運動頻率影響不明顯,各組之間比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表1 電針對各組大鼠胃運動幅度及頻率的影響 (s)

表1 電針對各組大鼠胃運動幅度及頻率的影響 (s)

注:與空白組比較1)P＜0.01;與中脘＋胃俞組比較2)P＜0.01

空白組 8中脘組 8胃俞組 8中脘＋胃俞組 8 2.31±0.20 4.67±0.36 4.11±0.281)2) 4.60±0.43 4.01±0.381)2) 4.95±0.31 5.98±0.401) 4.85±0.38

2.2 各組大鼠DVC區(qū)c-fos表達比較

圖2、3可見,電針中脘、胃俞以及中脘＋胃俞均能上調(diào)大鼠腦DVC區(qū)c-fos的表達,各電針組與空白組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);中脘＋胃俞組與中脘組和胃俞組比較,DVC區(qū)c-fos的表達顯著上調(diào),差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);中脘組和胃俞組之間比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

3 討論

迷走神經(jīng)運動背核(dorsal motor nucleus of the vagus,DMV)和孤束核(nucleus tractus solitarius,NTS)是調(diào)節(jié)胃運動和分泌的的中樞部分,兩者位置上緊鄰,功能上密不可分,共同構(gòu)成迷走背核復合體(dorsal vagal complex,DVC),發(fā)揮對胃運動的調(diào)節(jié)。本研究利用電針胃俞募穴,以原癌基因 c-fos的表達為標志,通過癌基因c-fos的表達產(chǎn)物Fos蛋白在與胃運動密切相關(guān)的中樞延髓 DVC中的表達情況,來探討胃俞募配穴對胃運動的調(diào)節(jié)作用及其中樞機制。原癌基因 c-fos廣泛存在于真核細胞基因組內(nèi),絕大多數(shù)正常細胞都有c-fos極低水平的表達[5]。c-fos表達可能是神經(jīng)元被刺激激活的一種標志,可用以分析中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元受到外周刺激后的活動變化[6,7]。當機體受到某種刺激時,在該刺激信息向中樞傳導的神經(jīng)通路上,相應神經(jīng)元會出現(xiàn)Fos蛋白陽性表達,用免疫組織化學的方法可以將其顯示出來。雖然我們應用的是形態(tài)學的方法來顯示,但是某種程度上反映了一定的功能意義。

圖1 各組大鼠胃運動收縮波

圖2 各組大鼠免疫組化染色顯示DVC區(qū)c-fos的表達(SABC,×400)

圖3 電針胃俞募穴對各組大鼠DVC區(qū)c-fos表達的影響

既往研究中,我們觀察到 DVC是針刺調(diào)整胃運動和分泌的重要中樞部位[8]。有研究表明,在針刺調(diào)整胃運動作用中,DMV和NTS神經(jīng)元被明顯激活[9]。在筆者實驗的免疫組化染色觀察中,電針胃俞募穴后大鼠的Fos蛋白陽性反應產(chǎn)物集中表達在延髓DVC中,且表達較空白對照組明顯增加,其中,中脘＋胃俞組Fos蛋白的表達較單獨針刺中脘和胃俞組增加明顯。這一實驗結(jié)果表明,電針胃俞募穴對中樞核團 DVC具有激活作用。與此同時,實驗還顯示在電針刺激胃俞募穴位的情況下,胃運動的幅度明顯增加,且俞募配穴效果更顯著。因此提示胃俞募配穴對胃運動的調(diào)節(jié)作用具有協(xié)同效應。根據(jù)本實驗結(jié)果,我們可以初步推斷,電針胃俞募穴對胃運動的調(diào)節(jié)作用可能是通過激活對胃運動具有調(diào)節(jié)作用的中樞延髓DVC中的神經(jīng)元而實現(xiàn)的。

由上述的實驗結(jié)果,我們可以看出,電針胃俞募穴對胃運動具有調(diào)節(jié)作用,而且這種調(diào)節(jié)作用的實現(xiàn)與中樞核團DVC神經(jīng)元的激活有密切關(guān)系,表明DVC參與了胃俞募配穴對胃運動的調(diào)節(jié)作用,初步揭示胃俞募配穴的中樞作用靶點。為進一步證實胃俞募配穴作用的中樞靶點,本項目組下一步將通過微透析技術(shù),探討DVC內(nèi)單胺類和氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量變化,并摧毀中樞核團DVC,觀察電針胃俞募穴對胃運動的作用。

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