健脾養血祛風法對小鼠皮膚屏障功能影響的實驗研究

葉建州， 楊雪松，李 欽

（1.云南省中醫醫院，云南 昆明650021；2.云南省中醫中藥研究院，云南 昆明650223）

角質層是皮膚表皮的最外層，能直接體現出皮膚的外觀和健康狀況，并在保障皮膚正常的屏障功能上起重要作用。神經酰胺（ceramide）是一種類磷脂，它占角質層脂質中40%～50%比重，是角質層的主要成分，它在保持角質層水分平衡，維護皮膚屏障功能起到極其重要的作用，相當于角質細胞磚之間泥漿的主要成分，表皮層除去神經酰胺就能使皮膚屏障功能幾近喪失。

特應性皮炎（atopic der matitis，AD）患者不僅病變部位皮膚神經酰胺的含量明顯減少，并且正常皮膚處神經酰胺的含量也較正常人低，經表皮喪失水分也叫正常人多，常伴有皮膚干燥癥［1～2］。皮膚神經酰胺含量的減少是特應性皮炎患者皮膚屏障功能低下的指標。瘙癢是特應性皮炎的一個重要特征［3］。

本實驗通過復制大黃所致脾虛動物模型并進一步復制瘙癢（血燥）模型，通過程度其表皮神經酰胺含量這一皮膚屏障功能的重要指標，瘙癢行為及表皮厚度，探討健脾養血祛風法對皮膚機械屏障功能的影響，探索特應性皮炎中醫治療規律及機制。

1 實驗基礎條件測定、儀器及材料

1.1 小鼠表皮脂質的抽提及表皮中神經酰胺含量測定

1.1.1 取材 選用ICR小鼠，將小鼠處死，剪毛，取下剪毛后的皮膚，用直徑為8 mm的打耳器經剪下的皮膚打成0.5 c m2大小的皮膚圓片，每只鼠打6個圓片作為一份皮膚樣品，總面積為3 c m2

1.1.2 實驗儀器 BIO－RAD Gel Doc凝膠成像系統，勻漿機FLUKO F6／10，高速離心機 北京京立離心機有限公司LG10－2.4 A，低溫冰箱 日本產SANYO MDF－U33，電子天平上海普利塞斯有限公司XS125A。

1.1.3 藥品與試劑 神經酰胺標準品和朊酶：美國西格瑪公司，氮氣（昆明氧氣廠），磷酸鹽緩沖液（PBS液），正乙烷，乙酸乙酯，氯仿，甲醇氨水，硫酸銅，磷酸，醋酸 產自國藥集團化學試劑有限公司（均為分析純）；其他材料：定量毛細管，薄層色譜硅膠板，定量濾紙，薄層色鋪展開缸，耳腫打耳器，移液器。

1.1.4 表皮中神經酰胺含量測定 將所取皮膚浸泡于朊酶液中，放置過夜，分離表皮，按Blight＆Dyer法［4］抽提表皮脂質，－40℃保存。

1.1.4.1 對照品溶液的制備 精密稱取神經酰胺對照品0.0052 g，置5 mL容量瓶中，加氯仿適量，振搖使溶解，加氯仿稀釋至刻度，搖勻。從中精密吸取1 mL溶液，置5 mL容量瓶中加氯仿適量，振搖使溶解，加氯仿稀釋至刻度，搖勻。即得0.208 mg／mL對照品溶液。用0.10 mL氯仿溶解所抽提出的脂質，即得供試品溶液。

1.1.4.2 供試品溶液的制備 用0.10 mL氯仿溶解所抽提的脂質，即得供試品溶液。

1.1.4.3 薄層色譜條件 薄層板：北京頗賽科技公司Silca gel 60，點樣：點樣基線距底邊1 c m，將樣品點于基線上。展開：薄層板于氯仿：甲醇：水（80∶20∶1）中上行展開，取出晾干。顯色：硫酸銅磷酸溶液顯色，與140℃下烘至顯色。

1.1.4.4 含量測定方法 顯色后的薄層板用BIO－RAD Gel Doc凝膠成像系統采集圖像，Quantity One軟件分析，進行含量測定。

1.1.4.5 方法學考察 工作曲線的繪制：精密吸取對照品溶液2、4、6、8、101分別點于統一薄層板上，按上述薄層色譜條件展開、顯色、采集圖像、分析定量。經神經酰胺線性關系考察后，利用回歸方程計算相關系數，表明神經酰胺在0.416～2.08μg范圍內，含量與密度積分值線性關系良好。

1.2 瘙癢測定方法［5］

1.2.1 造模方法 于造模前1 d，剪掉頸背部毛，用4 c m2脫脂棉蘸取丙酮、乙醚混合液（1：1）覆蓋于剪毛處15 s，而后取另一4 c m2脫脂棉蘸取蒸餾水覆蓋于剪毛處30 s，2次／d，2次時間間隔至少為6 h。

1.2.2 瘙癢行為［5］于第14 d觀察各組動物瘙癢行為，在BI－2000醫學圖像分析儀系統下錄像2小時10秒，前10 min為適應期，錄像結束后觀察并記錄后2 h內各組動物的以后足搔抓造模部位的次數。

2 方法與結果

2.1 實驗方法及藥物制備 將70只體重在18～25 g的ICR小鼠隨機分為7組，清潔級，雌雄各半，每組10只（由四川省醫學科學院實驗動物研究所提供，許可證號：SCXK（川））。分為空白組，大黃模型組，治療高劑量組，治療低劑量組，預防模型組，預防高劑量組，預防低劑量組。大黃濃縮液：以大黃水煎、過濾、合并濾液、濃縮制成浸膏，以蒸餾水稀釋為200%藥液，4℃保存。健脾養血祛風方：按方中比例水煎、過濾、合并濾液、濃縮制成浸膏，以蒸餾水稀釋為120%藥液，4℃保存。

2.2 造模方法 對照組給予等量蒸餾水。模型組：大黃組［6］，灌胃給予200%大黃水煎液，0.5 mL／只，1次／d，連續8 d，造成瀉下脾虛模型。治療高劑量組：灌胃給予200%大黃水煎液，0.5 mL／只，1次／d，連續8 d，造成瀉下脾虛模型，第9 d同時開始給予瘙癢2次／d，2次間隔大于6 h，連續5 d，共13 d。第11 d時灌胃24.375 g生藥／kg健脾養血祛風方濃縮液，1次／d。治療低劑量組：灌胃給予200%大黃水煎液，0.5 mL／只，1次／d，連續8 d，造成瀉下脾虛模型，第9 d同時開始給予瘙癢2次／d，兩次間隔大于6 h，連續5 d，共13 d。第11 d時灌胃8.125 g生藥／kg健脾養血祛風方濃縮液，1次／d。預防模型組：灌胃蒸餾水5 d后，第6 d灌胃給予200%大黃水煎液，0.5 mL／只，1次／d，連續8 d，造成瀉下脾虛模型，第9 d同時開始給予瘙癢2次／日，2次間隔大于6 h，連續5 d，共13 d。預防高劑量組：灌胃24.375 g生藥／kg健脾養血祛風方（組成：黃芪30 g，白術15 g，當歸15 g，制首烏30 g，防風20 g，刺蒺藜30 g，蜈蚣15 g）濃縮液，1次／日，5 d后，第6 d灌胃給予200%大黃水煎液，0.5 mL／只，1次／日，連續8 d，第9 d同時開始予瘙癢2次／d，2次間隔大于6 h，連續5 d，共13 d。

預防低劑量組：灌胃8.125 g生藥／kg健脾養血祛風方濃縮液，1次／日，5 d后，第6 d灌胃給予200%大黃水煎液，0.5 mL／只，1次／日，連續8 d，第9 d同時開始予瘙癢2次／日，2次間隔大于6 h，連續5 d，共13 d。

2.3 觀察指標

2.3.1 一般行為［7］觀察各組動物的行為狀態，注意觀察大黃組動物是否出現精神倦怠，嗜臥，懶動，拱背，扎堆，眼瞇，毛色枯黃，甚至稀少，耳，尾色白，軟便，便溏，泄瀉，體重增長減慢或體重下降，食量減少等脾虛癥狀。出現5個以上即可認為脾虛模型復制成功。

2.3.2 表皮神經酰胺測定 按“小鼠表皮脂質的抽提及表皮中神經酰胺含量測定方法研究”中方法取皮，抽提出表皮脂質并測定其中神經酰胺的含量。

2.3.3 瘙癢行為 按上文“瘙癢方法”統計各組小鼠瘙癢次數并比較各組間差異。

2.4 統計方法 神經酰胺，瘙癢次數和表皮厚度統計方法：用多個樣本均數間兩兩比較，q檢驗的方法，（Newmankueuls法）。

2.5 實驗結果 大黃組動物灌胃給予大黃，大黃治療模型組：2天后出現便軟，稀便，第4天出現腹瀉，稀水便，懶動，扎堆，毛憔悴。體重增長減慢，進食量減少。空白組動物無異常情況，體重增加迅速，進食量增加。

表2 瘙癢次數測定結果

表3 各組動物剪毛造模部位表皮厚度測量結果

3 討論

特應性皮炎是中醫學“浸淫瘡”，“奶癬”及“四彎風”范疇。多因“先天稟性不耐，脾失健運，水濕停滯，化熱內生，浸淫肌膚“而發病。脾失統導致在疾病早期津液大量外滲，滲液日久不僅使脈中之津液不足，脈絡空虛，因虛而致風，血虛風燥，膚失所養而遷延不愈。其病理基礎是以虛為本，以風濕熱邪為標。主要表現為脾虛濕熱證（急性濕疹），脾虛濕阻證（亞急性濕疹），脾虛血燥證（慢性濕疹）3型。急性期為脾失健運，運化失司，濕濁內蘊，日久化熱，浸于肌膚，久則生風化燥，脾虛血燥肌膚失養［8］。急性期以清熱解毒、健脾滲濕為主，慢性期以健脾養血，祛風止癢為主，并在此基礎上根據兼有癥狀加減已成為共識，治療中不能一味地清熱利濕［9］，基于特應性皮炎的癥狀特點，結合中醫病因病機學說，臨床用藥規律和現代中醫研究成果，脾虛是特應性皮炎患者的體質特征，慢性期脾虛血燥患者可能有不同程度的皮膚屏障功能障礙。瘙癢可促使淋巴細胞釋放化學因子如白介素1а等，不但是瘙癢進一步加劇，而且導致濕疹樣皮疹的產生和加重，并形成惡性瘙癢－搔抓循環。在長期的臨床時間中觀察到特應性皮炎患者大多表現為皮損肥厚、干燥、脫細屑、納差、便溏等脾虛血燥證的表現。無論從中醫基礎理論分析還是多年的臨床實踐來看特應性皮炎的辨證治療均緊密圍繞以脾為主的辨治思路，慢性期則為久病耗傷脾氣，氣血生化之源受損，脾虛亦為血虛之本，而”血虛不能養膚，風從內生”，脾虛血燥貫穿特應性皮炎整個慢性期過程。近年來，特應性皮炎患病率居高不下，三歲以內的兒童患病率為44%［10］。現代醫學研究表明，特應性皮炎病因學主要涉及皮膚的機械屏障和免疫屏障功能的異常［11］。

基于特應性皮炎的癥狀特點，結合中醫病因病機學說，臨床用藥規律和現代中醫研究成果，脾虛是特應性皮炎患者的體質特征，脾虛血燥患者可能有不同程度的皮膚屏障功能障礙。本文對脾虛血燥與皮膚機械屏障功能關系進行了實驗研究。結果顯示，皮膚機械屏障功能瘙癢模型組小鼠神經酰胺含量下降，瘙癢次數增多，表皮厚度增厚，與空白組比較，有明顯統計學意義。治療高、低劑量組及預防高、低劑量組的神經酰胺含量升高，瘙癢次數減少，表皮厚度變薄比較皮膚機械屏障功能瘙癢模型組小鼠有顯著性差異。健脾養血祛風湯組成方藥為云南省中醫醫院皮膚科已故劉復興主任醫師的經驗方。其方健脾養血祛風止癢，健脾益血，水谷精微化生有源，津血同源，氣血健運，津液濡潤，肌膚腠理得養，皮膚屏障功能得以維持。

苦寒藥致脾虛是目前最常用的脾虛造模方法。《脾胃論》：“大忌苦寒之藥傷其脾胃。”臨床過用苦寒及苦寒瀉下常致耗氣破氣，脾胃氣虛。大黃為苦寒瀉下法中最常用的藥物，其性寒味苦，含多量蒽醌衍生物。苦寒瀉下法致致脾虛屬脾氣虛。

瘙癢是以特應性皮炎為代表的一類干燥性皮膚病的臨床主要癥狀之一，也是皮膚屏障功能障礙的主要癥狀表現［12～13］，反復搔抓皮膚可使皮膚病變惡化和遷延，使瘙癢進一步加劇，本研究選用丙酮、乙醚混合液致小鼠皮膚瘙癢，原理基于皮膚與有機溶劑接觸可提取皮膚脂質，致皮膚屏障功能顯著降低［14］。通過復制大黃所致脾虛動物模型并進一步復制瘙癢（血燥）模型，通過程度其表皮神經酰胺含量這一皮膚屏障功能的重要指標，及表皮厚度、瘙癢行為，探討脾虛血燥與皮膚機械屏障功能的關系。

中醫藥治療特應性皮炎有其獨特的優勢，過去我們在對過敏性皮膚病的臨床及實驗研究中過分強調中藥的抗炎、抗組胺作用，但抗炎、抗過敏難以體現中醫藥治療過敏性皮膚疾病的優勢。許多中藥中藥制劑在實驗研究中確實表現出一定程度的抗炎、抗組胺的作用，可強度遠不及抗組胺藥、糖皮質激素類藥物；在臨床治療上中藥雖然起效慢，但遠期療效好，復發率低是客觀事實，許多患者是在抗組胺藥、糖皮質激素治療無效的情況下，轉用中藥治療而獲效的，提示我們中藥可能是通過其他途徑發揮治療作用的。

4 結論

健脾養血祛風法可以減輕大黃法所致脾虛血燥小鼠瘙癢程度，提高神經酰胺含量健脾養血祛風法能改善大黃法所致小鼠脾虛血燥證的皮膚機械屏障功能障礙。脾虛血燥證在研究脾虛與皮膚這一人體最大器官關系的動物模型尚不多，本實驗為今后建立復合型及最大程度接近臨床疾病癥狀，解釋證的本質的研究，用動物模型提供了思路與依據。

［1］Seidenari S，Giusti G.Objective assess ment of t he skin of children affected by atopic der matitis：a study of p H，capacitance and TEWL in eczemat ous and clinically uninvolved skin.Acta Der m Venereol，1995；75（6）：429～433.

［2］Matsu moto M，Sugiura H，Uehara M.Skin barrier f unction in patients wit h co mpletely healed at opic der matitis.J Der matol Sci，2000；23（3）：178～182.

［3］Imokawa G.Lipid abnor malities in atopic der matitis.Ja m Acad Der matol，2001，45（1 suppl）：S29～S32.

［4］Blight EG，Dyer WJ.A rapid method of total lipid extraction and purification.Can J Biochem Physiol，1959；37（8）：911～917.

［5］Miya mot o T，Noji ma H，Shinkado T，et al.Itch－associated response induced by experi mental dry skin in mice.Jpn J Phar macol，2002；88（3）：285～292.

［6］鄭金海，宋小東，李慶豐 .大黃致脾虛及四君子湯復健小鼠血漿中CA MP與脾PFC含量的變化［J］.蘭州大學學報，1994；30（4）108～110.

［7］陳小野，周永生，樊雅莉，等 .脾氣虛證動物模型規范化的初步研究［J］.中國醫藥學報 .2001；16（4）：52.

［8］安家豐，張芃 .張志禮皮膚病醫案選萃［M］.北京：人民衛生出版社，1996，131～132.

［9］龔麗萍 .益氣養陰、健脾活血法治療異位性皮炎［J］.實用中西醫結合臨床.2004；4（6）：50～51.

［10］Liselott BH，Lotte L，Frederik F，et al.Develop ment of atopic dermatitis during the first 3 years of life：the Copenhagen prospective st udy on ast h ma in childhood cohort st udy in high－risk children.Arch Der matol 2006；142：561～566.

［11］Jensen JM，Folster－ Holst R，Baranowsky A，et al.Impaired sphingo myelinase activity and epider mal differentiation in atopic der matitis.J Invest Der matol，2004；122（6）：1423～1432.

［12］Sege JA.Epider mal barrier f or mation and recover y in skin disorders.J Clin Invest；2006，116（5）：1150～1158.

［13］Rawlings AV，Handing CR.Moisturization and skin barrier f unction.Der matol Ther；2004，17（1）：43～48.

［14］Abrams K，Harvell，JD，Shriner，D，et al.Dissolution of materials in artificial skin surface fil m liquids.J Invest Der matol；1993；101：609～613.