豬肺炎支原體和豬鼻支原體雙重PCR檢測方法的建立與應用

劉茂軍，王占偉，韋艷娜，馬慶紅，楊莉莉，周勇岐，，邵國青

(1.江蘇省農業科學院獸醫研究所·農業部獸用生物制品工程技術重點實驗室·國家獸用生物制品工程技術研究中心，南京 210014;2.南京天邦生物科技有限公司，南京 211102)

豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是豬支原體肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine，MPS)的主要病原，該病又稱豬氣喘病或豬地方流行性肺炎(EPP)，是一種豬的慢性呼吸道傳染病，在全世界廣泛存在，長期以來被認為是最常發生和經濟意義重大的豬病之一。該病常繼發或混合感染其他細菌性或病毒性疾病，引起豬呼吸道病綜 合 征 (Porcine respiratory disease complex，PRDC)［1］。 豬 鼻 支 原 體 (Mycoplasma hyorhinis，Mhr)也是豬呼吸道病綜合征的病原之一，并可引起多發性漿膜炎和多發性關節炎，臨床上與副豬嗜血桿菌病易混淆，使鑒別診斷難度增大［1-3］。Mhr可通過濾器，在細胞培養過程中，Mhr是最主要和最常見的污染源之一，使細胞凋亡或者細胞活力下降，最終導致細胞廢棄;Mhr易生長且生長快，常掩蓋Mhp，導致 Mhp分離和培養失敗［4-6］。目前，檢測Mhp的常用方法有分離培養、微粒凝集、熒光抗體法、核酸探針法和PCR法。Mhr的檢測方法報道較少，主要是分離培養和PCR等。Mhp的培養條件比Mhr要求苛刻，常被Mhr所掩蓋。血清學檢測方法兩者之間存在交叉反應，難以區分，從而給Mhp的鑒別診斷帶來了困難［7］。PCR法較其他方法敏感、快速，適宜于大批樣品的檢測以及流行病學的調查，目前兩個病原都分別建立了普通PCR方法［8-9］。本文在先前研究的基礎上，建立了Mhp和Mhr的雙重PCR檢測方法，為這兩個病原的檢測提供了快速、準確的方法。

1 材料

1.1 菌株和樣品 Mhp、Mhr、絮狀支原體(Mf)、雞毒支原體(Mg)、副豬嗜血桿菌(HPs)、胸膜肺炎放線桿菌(App)、豬鏈球菌2型(SS-2)、豬瘟病毒(CSFV)、豬圓環病毒2型(PCV2)和藍耳病病毒(PRRSV)為江蘇省農業科學院獸醫研究所保存。69批次豬支原體肺炎活疫苗(168株)由南京天邦生物科技有限公司生產。120份MPS臨床肺組織于2011年采集自南京某屠宰場。5份細胞樣品來源于江蘇省農業科學院獸醫研究所。

1.2 試劑 PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR試劑購自TaKaRa公司。

2 方法

2.1 模板制備 按照參考文獻的采樣方法采樣，采集待檢豬肺臟的病變組織與健康組織交界部位，研磨、反復凍融、煮沸提取 DNA，作為模板，置于-20 ℃ 保存［8］。

2.2 引物設計 根據GenBank Mhp 16S rRNA基因(Y00149.1)和 Mhr 16S rRNA 基因(M24658.1)的序列設計引物，引物序列為:

以上引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

2.3 雙重PCR方法的建立 PCR擴增體系為:10 × PCR Buffer(Mg2+Free)2 μL，25mmol/L MgCl21 μL，各 2.5 mmol/L dNTPs Mixture 2 μL，20 pmol/μL Mhp 引物 0.5 μL，20 pmol/μL Mhr引物0.5μL，20 pmol/μL MR 引物1 μL，模板 DNA 2 μL，5 U/μLTaq 酶 1 μL，加 ddH2O 至20 μL。反應條件為:95℃預變性5 min，94℃變性30 s，54℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個循環，72℃終延伸10 min。取10 μL PCR擴增產物，用1%的瓊脂糖凝膠在120 V電壓下電泳鑒定。若出現1000 bp條帶的樣品，判為Mhp陽性;若出現1129 bp條帶的樣品，判為Mhr陽性。

2.4 PCR 的特異性試驗 取 Mhp、Mhr、Mf、Mg、HPs、App、SS-2、CSFV、PCV2 和 PRRSV，獲得基因組DNA或cDNA，同上體系進行PCR反應，來確定PCR的特異性。

2.5 PCR擴增的敏感性試驗 Mhp和Mhr模板用紫外分光光度計測得濃度分別為3.3 μg/mL和2.9 μg/mL，然后進行一系列10倍梯度稀釋到10-5，然后按照同上的PCR擴增體系和條件進行PCR，以檢測此方法的敏感性。

2.6 樣品檢測 使用上述建立的雙重PCR法對豬場采集肺組織120份、69批次豬支原體肺炎活疫苗(168株)和5份疑似支原體污染細胞進行檢測。

3 結果與分析

3.1 PCR擴增結果 用Mhp和Mhr陽性樣品作為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳結果表明，PCR成功地擴增出1000bp(Mhp)和1129bp(Mhr)大小的條帶(圖1)，與預期結果相符。

3.2 PCR 特異性實驗結果 以 Mhp、Mhr、Mf、Mg、HPs、App、SS-2、CSFV、PCV2 和 PRRSV 的基因組DNA或cDNA為模板，利用已經建立的雙重PCR進行檢測。瓊脂糖凝膠電泳結果如圖2，Mhp和Mhr均擴增出目的條帶，Mf、Mg、HPs、App、SS-2、CSFV、PCV2和PRRSV均未出現相應條帶。

3.3 雙重PCR的敏感性試驗結果 將Mhp DNA模板(濃度為3.3 μg/mL)和 Mhr DNA 模板(濃度為2.9 μg/mL)進行一系列10倍梯度稀釋，按照同上的PCR擴增體系和條件進行PCR，瓊脂糖凝膠電泳結果如圖3，顯示Mhp和Mhr最低可從10-4倍稀釋的模板中擴增到目的條帶，說明該雙重PCR的最低檢出量 Mhp 為0.66 ng，Mhr為 0.58 ng。

圖3 Mhp和Mhr的敏感性試驗結果

3.4 樣品的雙重PCR檢測結果 利用Mhp和Mhr雙重PCR法檢測120份臨床豬肺可疑樣品、69批次豬支原體肺炎活疫苗(168株)和5份疑似支原體污染細胞。結果顯示，臨床樣品中，28份是Mhp 陽性(23.3%)，17 份是 Mhr陽性(14.1%);69批次豬支原體肺炎活疫苗(168株)全部為Mhp陽性，無Mhr污染;5份疑似支原體污染細胞全部為Mhr陽性。以上試驗結果均與建立的 Mhp P36 PCR和Mhr P37 PCR［7-9］方法檢測結果一致。部分瓊脂糖凝膠電泳結果如圖4。

圖4 樣品的雙重PCR檢測結果

4 討論

近年來，豬病的發生多以混合感染出現，這在疾病的診斷上帶來了困難。Mhp的感染常常是引起豬呼吸道病綜合征發生的重要條件。在Mhp感染豬時，常伴有Mhr的感染，而Mhr感染豬的臨床表現與HPs極其相似，且目前HPs發病率較高，易導致誤判。目前的檢測方法主要有分離培養、PCR、血清學等。由于Mhp較Mhr培養條件苛刻，在分離培養Mhp時常被Mhr所掩蓋，給分離培養帶來困難和錯誤。在血清學上Mhp與Mhr具有一定的交叉性，因此，血清學方法具有一定的假陽性。本研究利用16S rRNA在細菌種間的保守性，設計了3條針對Mhp和Mhr 16S rRNA基因的特異性引物，可特異性的擴增到Mhp和Mhr，這將為Mhp和Mhr的可疑病料以及Mhp和Mhr污染樣本的檢測提供了快速簡便準確的方法。

本研究建立的Mhp和Mhr雙重PCR法，經特異性試驗證明，能特異性的檢測出Mhp和Mhr，而與供試的其他病原均不反應。敏感性試驗證明，該方法最低可以檢測到0.66 ng的Mhp基因組DNA和0.58 ng的Mhr基因組DNA;目前報道了P36的敏感性為0.426 ng Mhp基因組 DNA，P46為0.5 ng Mhp基因組DNA，該方法與先前的報道相近［8-9］。因此，集高特異性和高敏感性于一體的Mhp和Mhr雙重PCR法將在其檢測和鑒別中發揮重要的作用。

豬支原體肺炎在大多數豬場長期存在，Mhp和Mhr是其主要病原。王貴平報道長沙市中小豬場和散養戶病料中Mhp陽性率為 24.4%，Mhr陽性率為22.3%;Lin J H 等報道等［10］臺灣 Mhp和 Mhr的感染率分別為15.9%和19.0%。本次試驗從采集的屠宰場樣品中檢出Mhp陽性率23.3%，Mhr陽性率14.1%，這可能是采樣時間、范圍及對象的差異所致。這也說明Mhp和Mhr在豬群中也有感染，其對養豬業的危害值得進行調查。

Mhr由于其可感染動物和人，且培養要求較低，所以成為了支原體和細胞培養的頭號敵人。據報道污染細胞的支原體主要來源于人、豬和牛，對495株細胞的檢測，發現最常見的包括:發酵支原體(47%)、豬鼻支原體(19%)、口腔支原體(10%)、精氨酸直言體(9%)萊氏無膽甾原體(6%)、人型支原體(3%)［6］。本試驗中從南京天邦生物科技有限公司生產的15批次豬支原體肺炎活疫苗(168株)中均檢測到了Mhp，而未檢測到Mhr，說明疫苗在污染控制上嚴格。試驗中檢測的疑似支原體污染細胞均檢測到了Mhr，這也驗證了Mhr在細胞培養污染中的較為常見。

本試驗中設計的雙重PCR了3條引物特異性良好，敏感度與普通PCR接近，是一個較為簡便快速的Mhp和Mhr檢測和鑒定的方法。但本試驗中Mhp和Mhr擴增產物在1000 bp以上，使PCR的延伸時間較短片段長，另兩個目標片段大小相差129 bp，給兩者的鑒別帶來了一些困難。通過條件優化，2 h內即可完成檢測，與常規PCR基本相當，目前也正在進行改進研究。

總之，采用雙重PCR法檢測可疑MPS病料，以及疫苗和細胞是否感染Mhp或者Mhr，是一種快速準確的檢測診斷方法，對Mhp和Mhr的檢測具有一定的應用價值。

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