液相色譜串聯質譜法測定飼料中黃霉素A的含量

李金強，沙美蘭，李曉玉，尹大路

(煙臺出入境檢驗檢疫局，山東煙臺 264000)

黃霉素(Flavomycin)又名斑伯霉素、莫諾霉素［1-2］，至少含有5種活性成分，以黃霉素A為主，其分子量為1582，主要對革蘭氏陽性菌有抗菌作用［3-7］。中國于1993年允許使用，目前在養殖業中被廣泛應用，早在2005年歐盟農業部長會議就決定，黃霉素等四種抗生素自2006年起禁止使用，其他許多國家也相繼出臺了禁用規定［8-9］。目前檢驗檢疫部門已將黃霉素列為飼料和動物源性食品殘留監控計劃，因此該方法的制定將為飼料中黃霉素檢測及監控計劃提供技術支持。由于黃霉素預混劑主要成分為黃霉素A，含量大于總活性的成分的 50%［10］，農業部獸藥質量標準中也有規定［11］，可以通過檢測黃霉素A的含量間接監控樣品中黃霉素的添加量。黃霉素對動物骨骼的發育有影響，大量攝入對造血功能有損害，其對動物及人體的其他危害尚在研究中［12-14］。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 分析天平(感量0.1 mg);6490液相色譜-串聯質譜儀ESI源(美國安捷倫公司);固相萃取裝置;milli-Q超純水系統;0.45 μm濾膜;漩渦混合器;離心機(安亭)。500 mg/6 mL HLB固相萃取柱，購自Waters公司;甲醇、乙腈均為色譜純，購自德國Meker公司;乙酸銨為分析純;實驗用一級水由Millipore超純水系統制備;乙酸銨溶液(10 mmol/L):稱取0.77 g乙酸銨加適量水溶解，最后定容至1000 mL，用前過0.45 μm的濾膜，現用現配;提取液:25%氨水+甲醇(1+9)體積比。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃霉素A標準溶液 黃霉素標準品購自德國Dr.Ehrenstorfer公司，為預混劑，含量 8.0%，C 13655300，Lot:91105。稱取相當于含黃霉素A的標準品50 mg(準確至0.1 mg)的預混劑，用甲醇溶解并定容至50 mL，配制成濃度為1000 mg/L的標準儲備液，儲存于-18℃冰箱中(保存期6個月)，標準工作液和系列標準工作液根據需要現用現配。

1.2.2 樣品處理 樣品充分混勻后，稱取5 g(精確至0.1 g)，置于50 mL離心管中，準確加入提取液15 mL，蓋好試管蓋，在漩渦混合器上混勻2 min，5000 r/min離心5 min。將上清液轉移到另一個離心管中，殘渣中加入15 mL提取液，重復操作一次，合并兩次上清液，混勻備用。對于含油脂高的動物性飼料，將5 mL正己烷加入到提取液中，漩渦混合2 min，靜置分層后棄去上層正己烷層。準確移取15 mL上清液，于旋轉蒸發儀上45℃水浴蒸發至近干，加1 mL甲醇15 mL水溶解殘渣，充分混勻后注入經5 mL甲醇和5 mL水預先活化的HLB柱，控制過柱速度不超過1 mL/min，待樣液全部流過凈化柱后，用5 mL水淋洗柱子，抽干2 min后，用2 mL氨水甲醇(9+1)洗脫，洗脫液經氮氣吹至近干，用甲醇定容至1 mL，充分混勻后10000 r/min離心10 min，取上清液過0.25 μm的濾膜，濾液供質譜測定。

1.2.3 液相色譜條件 色譜柱:Agilent Ecillps C18 150 mm ×2.1 mm，內徑1.7 μm，或相當者;柱溫 25℃;流動相:A為乙腈，B為10 mmol/L乙酸銨溶液，梯度洗脫(表 1);流速 0.3 mL/min;進樣量 10 μL。

表1 流動相梯度參數

1.2.4 質譜條件 離子源:ESI源;掃描方式:負離子模式(negative);檢測方式:多反應監測(MRM);霧化氣溫度:350℃;毛細管電壓:4.0 kV;離子駐留時間:200 ms;碰撞能(CE值):22;碎裂電壓(fragmentor):135;選擇離子:m/z 789.9/553.8(定性離子)，m/z 789.9/575.7(定量離子)。

2 結果與分析

表2 不同提取試劑黃霉素A的檢測結果(n=5)

2.1 提取試劑與凈化條件的選擇 由于黃霉素為強極性化合物，易溶于水，在提取方式的選擇上，文獻中采用超聲提取的方式［1］，試驗中采用漩渦混合和水浴超聲兩種提取方式進行了對比，對同一添加濃度的樣品，提取時分別采用漩渦混合2 min和超聲10 min，結果兩種方法的回收率沒有顯著差別，但漩渦混合節約提取時間。提取溶劑的選擇上，有文獻采用甲醇甲酸銨提取［2］，也有用氨水甲醇提取［1］，對此方法設計了三種不同的提取試劑組合，結果見表2，由表2可見，三種不同的提取試劑組合中，1+9的氨水甲醇平均回收率為93.4%，其他的最高只有87.6%，因此選擇1+9的氨水甲醇作為飼料中黃霉素A檢測的提取試劑。凈化方法上，由于飼料成分復雜，基質干擾嚴重，在這種情況下，對一低濃度添加樣品(500μg/kg)設計了4種不同的凈化方法，一是過C18固相萃取柱，甲醇洗脫［2］;二是過HLB凈化柱，氨水甲醇洗脫［1］。結果見表3，由表3可見，提取液經HLB柱凈化所測得的黃霉素A的回收率高，幾乎無基質干擾，所以選用500 mg/6 mL HLB柱作為凈化柱。

表3 兩種不同的凈化柱對黃霉素A凈化提取的回收率(n=5)

以固體飼料為例，稱樣5 g，30 mL試劑提取一次。

2.2 質譜條件的確定 選擇質譜條件時，發現黃霉素A在電離時產生兩個母離子，即［M-H］-m/z 1580.7 和［M-H］2-m/z 789.9 見圖 1，離子［M-H］2-m/z 789.9的響應值較高，所以用選用［M-H］2-為檢測母離子，其子離子分別為 m/z 575.7(定量離子)和 m/z 553.8(定性離子)，子離子掃描TIC圖見圖2，MRM質譜色譜圖見圖3。

2.3 方法的線性范圍與檢出限 移取一定量的黃霉素A標準工作液，用甲醇稀釋成100、250、500、1250、5000 μg/L 的系列標準工作液，每次進樣10 μL進行測定，以質量濃度x為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，繪制標準工作曲線，線性圖見圖4，結果表明黃霉素A在該濃度范圍線性良好，線性方程為Y=37.0145x-269.2284，相關系數 r=0.999725。以S/N=3所對應的黃霉素A的含量30 μg/kg，作為方法的檢出限(LOD)，以S/N=10所對應的黃霉素A的含量100 μg/kg，作為方法的最低定量限(LOQ)。

圖3 黃霉素A標準(MRM)質譜色譜圖

圖4 線性圖

2.4 方法的回收率和精密度 為了確定方法的回收率和精密度，在動物性飼料和植物性飼料兩種基質中進行了不同濃度的黃霉素A添加回收試驗，結果見表4。由表4可見，兩種基質添加樣品的測定結果平均回收率均在70%以上，批內及批間相對標準偏差均小于10%，說明該方法有良好的精密度。

3 結論

檢測過程中的提取和凈化是關系到方法回收率和檢出限的關鍵所在，對方法的準確度和精密度均有較大的影響，另外儀器條件的選擇也關系到方法的靈敏度和檢出限。本項目在參考文獻的基礎上，經過優化，建立了飼料中黃霉素A的液相色譜串聯質譜檢測方法，方法簡便，數據重復性好，檢出限和定量限均能滿足日常檢測的要求，適合飼料中黃霉素A的測定。

表4 方法的回收率和精密度

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