超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞組織中氯苯胍殘留

李慧素，吳寧鵬，班付國，彭 麗，周紅霞

(河南省獸藥監(jiān)察所，鄭州 450008)

氯苯胍(Robenidine)是一種新型高效合成抗球蟲藥，分子式為C15H13Cl2N5，相對分子質(zhì)量為334，化學(xué)名:1，3-雙-對氯苯叉氨基胍，其結(jié)構(gòu)式如圖1。

圖1 氯苯胍化學(xué)結(jié)構(gòu)式

氯苯胍自1977年在我國上市后，因其療效顯著、毒性小，具有提高增重和飼料利用率的作用，在獸醫(yī)臨床上得到廣泛應(yīng)用。然而，過量使用或長期使用不當(dāng)會在禽肉產(chǎn)品中產(chǎn)生殘留。有報道稱，在肉雞日糧中添加量為66 g/t時，屠宰的新鮮肉質(zhì)中就會產(chǎn)生由于氯苯胍殘留而產(chǎn)生的異味，以33g/t的含量飼喂蛋雞時，在雞蛋中就會察出異味。因此應(yīng)在肉禽上市前5～7 d停藥，產(chǎn)蛋禽禁用。但是，一些養(yǎng)殖者為追求利潤，直到屠宰前才停止添加藥物，這樣肯定會使藥物殘留超標(biāo)，危害人民的身體健康。為了保障動物性食品的質(zhì)量安全，保證民眾的健康和產(chǎn)品出口，有必要對動物性食品中氯苯胍的殘留進(jìn)行監(jiān)控。

目前，中國、歐盟及美國等多個國家都制訂了氯苯胍在動物源食品中的最高殘留限量，我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定雞皮與脂肪中的最大殘留量為200 μg/kg，其他可食組織為 100 μg/kg［1］。目前，國外文獻(xiàn)報道的有 HPLC［2］、HPLC-MS/MS 檢測方法［3，6］，國內(nèi)報道主要是高效液相色譜法。本方法參考已有的文獻(xiàn)資料，通過多次試驗，建立了能很好滿足獸藥殘留檢測方法要求的雞組織中氯苯胍殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(Waters公司);XP205分析天平(瑞士 Mettler Toledo公司)，SIGMA 3-30K離心機(德國 Sigma公司);Spe-Al-N固相柱(500 mg/3 mL);HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL)。

1.2 試劑 甲醇、乙腈為色譜純;氯苯胍標(biāo)準(zhǔn)品含量為 93.0%，購于德國 Dr.Ehrenstorfer Gmbh公司;D8-氯苯胍標(biāo)準(zhǔn)品含量為99.3%，購于Sigma-Aldrich公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取氯苯胍標(biāo)準(zhǔn)品約10 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)貯備液1 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間工作液。

1.4 內(nèi)標(biāo)溶液的配制(1 mg/mL) 精密稱取D8-氯苯胍標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，于10 mL容量瓶中，用二甲亞砜溶解后，用甲醇稀釋至刻度，制成1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲備液。準(zhǔn)確吸取1 mL內(nèi)標(biāo)儲備液至10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，制成 100 μg/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。

1.5 試驗方法

1.5.1 色譜條件色譜柱:Acquity UPLC?BEH C18(2.1 mm ×100 mm，1.7 μm);柱溫30℃;流速0.3 mL/min;進(jìn)樣量 5 μL;流動相:A 相為乙腈，B相為0.1%甲酸水溶液;梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.5.2 質(zhì)譜參考條件 電噴霧離子源;正離子掃描;多反應(yīng)監(jiān)測;源溫度 120℃;脫溶劑溫度350℃;電離電壓3.0 kV;測試藥物定性、定量離子對及對應(yīng)的錐孔電壓和碰撞能量見表2。

表2 氯苯胍及內(nèi)標(biāo)定性、定量離子對及錐孔電壓、碰撞能量

1.5.3 樣品前處理 稱取均質(zhì)后(2±0.02)g試料，置于50 mL離心管內(nèi)，加入1 μg/mL氯苯胍-D8內(nèi)標(biāo)溶液 100 μL，再加入 0.1% 甲酸乙腈5 mL，渦旋混合后中速振蕩10 min，7500 r/min離心10 min，取上清液于另一10 mL離心管內(nèi)，加水1 mL，混勻。中性氧化鋁小柱用乙腈2 mL活化，取全部提取液過柱，收集全部流出液于10 mL玻璃試管中，再用85%乙腈2 mL洗脫，合并流出液，于40℃下氮氣吹至體積小于2 mL，再加入水8 mL，備用。HLB固相萃取柱依次用甲醇3 mL、水3 mL活化，取全部備用液過柱，用水3 mL淋洗，抽干30 s，正己烷3 mL淋洗，抽干10 min，甲醇5 mL洗脫，收集洗脫液，于40℃下氮氣吹干，殘渣用85%乙腈1.0 mL溶解，渦旋，過濾后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.5.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 量取氯苯胍標(biāo)準(zhǔn)工作溶液適量，用85%乙腈稀釋，制得濃度為10、20、50、100、200、500 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液(內(nèi)標(biāo)均為100 ng/mL)，由低濃度到高濃度供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。以特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.5 準(zhǔn)確度與精密度 取空白組織，在肌肉、肝臟、腎臟組織中添加50、100、200 μg/kg 三個不同濃度，在脂肪、皮中添加100、200、400 μg/kg 三個不同濃度，分別進(jìn)行準(zhǔn)確度和精密度試驗，各濃度進(jìn)行5個樣品平行試驗，重復(fù)3次，計算回收率及批內(nèi)、批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.5.6 檢測限與定量限 添加適量標(biāo)準(zhǔn)溶液于2.0 g空白樣品中，經(jīng)提取、凈化后測定，依據(jù)信噪比S/N≥3為檢測限，依據(jù)信噪比S/N≥10為定量限。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 按照上述方法制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在選定的色譜條件下，氯苯胍回歸方程為Y=8.9885X+146.89，相關(guān)系數(shù) r=0.9985。結(jié)果表明:氯苯胍在120～500 ng/mL的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，r＞0.99。

表3 空白雞組織中氯苯胍添加回收率試驗(n=5)

2.2 準(zhǔn)確度與精密度 按照上述方法，在空白組織中添加三個不同濃度的氯苯胍進(jìn)行回收率試驗。其結(jié)果見表3?？梢钥闯雎缺诫以诟闻K、肌肉、腎臟、脂肪和皮中平均回收率分別為 82.8% ～103.9%，85.0% ～ 107.6%、76.7% ～ 88.3%、80.9% ～91.6% 和 80.9% ～ 108.2%;批內(nèi)變異系數(shù)均在 1.0% ～20.0%之間，批間變異系數(shù)在2.5% ～12.8%之間。氯苯胍的標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白試樣、空白添加試樣特征離子質(zhì)量色譜圖見圖2-圖4。

2.3 檢測限與定量限 氯苯胍在肌肉、肝臟、腎臟、脂 肪和皮中的檢測限為5 μg/kg，定量限為10 μg/kg。

3 討論

3.1 提取條件 已報道的氯苯胍提取用溶劑有乙腈［3-4］、乙酸乙酯［5］、甲醇［2］等，通過比較發(fā)現(xiàn)，乙腈的提取效果要優(yōu)于甲醇和乙酸乙酯。根據(jù)氯苯胍的結(jié)構(gòu)特征，考察酸化乙腈和堿化乙腈兩種提取方法，發(fā)現(xiàn)用0.1%甲酸乙腈能獲得更高更穩(wěn)定的提取效果。

3.2 凈化條件 文獻(xiàn)中報道的用于凈化的固相萃取柱有硅膠柱、陽離子交換柱、C18柱等。本方法參考文獻(xiàn)的凈化方法，選擇 Wters Oasis HLB(3 mL，60 mg)、Waters Sep-Pak Vac C18(3 mL，60 mg)、VARIAN BOND ELUT-C18(3 mL，100 mg)三種固相萃取柱。結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種固相萃取柱對氯苯胍的回收率差別不大，但C18柱批內(nèi)的變異系數(shù)較大，因此選擇HLB柱進(jìn)行富集和凈化。

3.3 除脂肪方法 常用去除脂肪的方法包括液液萃取法、有機溶劑柱淋洗法［4-5］和固相萃取柱凈化。通過考察發(fā)現(xiàn)，在脂肪和皮組織中需要采用中性氧化鋁［2-3］固相萃取柱和正己烷淋洗HLB固相萃取柱兩步去除油脂，才能達(dá)到較好的凈化效果和較高的回收率。

3.4 離子對的選擇 根據(jù)歐盟2002/657/EC要求，要確證該類物質(zhì)至少需要4個識別點(IP)，結(jié)合文獻(xiàn)報道［3，6］，本試驗分別選擇了母離子以及對應(yīng)的兩個響應(yīng)較強的子離子作為定性定量依據(jù)。分別采用ESI+和ESI-離子模式進(jìn)行調(diào)諧，但以正離子模式響應(yīng)值最高。

4 結(jié)論

本方法建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞組織中氯苯胍殘留，采用內(nèi)標(biāo)法，對五種基質(zhì)樣品提取、凈化后測定，得到了較高的檢測的靈敏度和回收率。通過方法學(xué)考察，本方法完全適合雞組織氯苯胍殘留的定性和定量檢測。

［1］農(nóng)業(yè)部235號公告.動物性食品中獸藥最高殘留限量［S］.

［2］Kot-Wasik A，Wasik A.Determination of robenidine in animal feeds by liquid chromatography coupled with diode-array detection and mass spectrometry after accelerated solvent extraction［J］.Analytica Chimica Acta，2005，543:46-51.

［3］Malgorzata O，Teresa S J，Piotr J.Multi-residue confirmatory method for the determination of twelve coccidiostats in chicken liver using liquid chromatography tandem mass spectrometry［J］.Chromatography A，2009，1216:8141-8148.

［4］劉勇軍，吳銀良，姜艷彬.高效液相色譜法測定雞組織與雞蛋中氯苯胍的殘留量［J］.色譜，2010，28(9):905-907.

［5］周昭明，曾 勇，金秀娥.雞、兔組織中氯苯胍殘留的檢測方法研究［J］.中國獸藥雜志，2005，39(3):19-22.

［6］Delahaut P，Pierret G，Ralet N，et al.Multi-residue method for detecting coccidiostats at carry-over level in feed by HPLCMS/MS［J］.Food Additives and Contaminants，2010，27(6):801-809.