優化高氏Ⅰ號培養基在泰樂菌素菌種培養中的應用

張 麗，張 萍，石彥鵬，馬 燕

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司菌種研究所，銀川 750101)

泰樂菌素(Tylosin)是由弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)產生的一類大環內酯禽畜專用抗生素。廣泛應用于畜禽支原體疾病，細菌性疾病及螺旋體病和寄生蟲病的防治。特別是其強烈的抗支原體特性，使其成為治療畜禽支原體病的首選藥物，而且對禽、畜的生長有明顯促進作用，并且不殘留［1］。被國內外廣泛用作為飼料添加劑，是國家規劃重點發展的獸藥產品［2］。

在現有的泰樂菌素生產中，所用的斜面培養基多為麩皮培養基，而麩皮的質量、品種的變化以及制作時不易掌握、甚至在每次配制時的煮沸、過濾等人為操作差異都會影響到斜面配比的穩定。經典的用于培養放線菌的高氏I號斜面培養基在斜面培養基配制中雖然質量容易控制，較穩定，但是斜面孢子生長需14～15 d，周期長，不太適合大規模生產。本文在原有高氏I號培養基配方中加入豆餅粉和酵母浸膏粉，通過單因子實驗和正交試驗設計［3］對斜面配方進行優化，能夠兼具麩皮斜面生長快的優勢，在生產中得到良好的應用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 泰樂菌素產生菌 TLⅡ10-1222#由寧夏泰瑞制藥股份有限公司提供。

1.1.2 試劑及原料［4］麩皮(取本地產紅皮小麥自制)，氯化鈷(天津市風船化學試劑科技有限公司)，硫酸亞鐵、硫酸鋅、氯化鎂、氯化鈉、磷酸氫二鉀、硝酸鉀、硫酸鎂(均為天津市凱通化學試劑有限公司)，魚蛋白胨、酵母膏(北京奧博星生物技術有限公司)，酵母膏粉(英國進口)，玉米淀粉(通良萬順達生物科技有限公司)泰樂菌素標準品(中國獸藥監察所)，玉米漿(華北康欣)，豆餅粉(中寧縣天合工貿有限公司)，魚粉(吳忠玉環有限公司)，玉米粉(寧夏泰瑞制藥股份有限公司)，玉米蛋白粉(內蒙阜豐)，氯化鉀(俄羅斯)，硫酸鎳(陵縣匯豐鈷業)，鹽酸甜菜堿(濰坊祥維斯化學品有限公司)，磷酸氫二銨(什邡市百盛化工有限公司)，碳酸鈣(永登天玉化工有限公司)。

1.1.3 儀器與設備 旋轉搖瓶機，型號XDW25/96，四川長征制藥機械廠;紫外可見分光光度計，型號752N，上海精密科學儀器有限公司;恒溫恒濕控制系統，型號BUH-03B/BUH-03A，蘇州市北冰洋空調設備有限公司、凈化工作臺，型號YJ-HS-2，無錫市榮豐凈化空調設備廠。

1.2 方法

1.2.1 培養基

1.2.1.1 斜面培養基的制備:麩皮斜面培養基的制備，參見寧夏泰瑞制藥股份有限公司企業內控標準。將麩皮用純化水煮沸30 min，過濾取汁，加入魚蛋白胨、氯化鈷、硫酸亞鐵、氯化鎂、硫酸鋅、瓊脂用純化水溶解后定容到所需體積，調pH為7.80～8.00，分裝于250 mL 茄瓶中，120 ℃滅菌30 min，冷卻至不燙手時鋪成斜面，凝固后，孵至表面無游離水。高氏I號斜面培養基的制備，將玉米淀粉用純化水溶解，加熱，糊化后，加入硝酸鉀、硫酸亞鐵、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉、酵母膏粉、豆餅粉、瓊脂用純化水溶解后定容到所需體積，調pH為7.20～7.40，分裝于 250 mL 茄瓶中，在 120 ℃、0.11MPa下滅菌30 min，冷卻至約50℃鋪成斜面，凝固后，孵至表面無游離水。

1.2.1.2 種子瓶培養基、發酵瓶培養基制備參見參考文獻［4］。

1.2.2 接種培養 取沙土管保藏的生產菌種適量，加生理鹽水制備成孢子懸浮液，用玻璃棒蘸取菌懸液在茄瓶內連續劃線，均勻密集地涂滿整個斜面。每種培養基各接斜面10瓶，置于恒溫室中培養，按照寧夏泰瑞制藥股份有限公司企業內控標準規定的條件分別培養至 7、8、9、10、11 d，分別觀察斜面孢子成熟度。

1.2.3 實驗方法

1.2.3.1 在高氏I號斜面培養基中分別添加豆餅粉、酵母膏粉、玉米漿進行單因子實驗。

1.2.3.2 結合單因素實驗結果對高氏I號斜面培養基基礎配方中添加的酵母膏粉、豆餅粉及斜面孢子培養周期采用正交設計L25(56)的進行優化。

2 結果與分析

2.1 在高氏I號培養基(對照組)中分別添加不同比例的豆餅粉、酵母膏粉和玉米漿，并與高氏I號、麩皮培養基斜面孢子同期對比，以發酵搖瓶酸化液的化學效價為數據測定標準，其實驗數據如下表1。

表1 豆餅粉、酵母膏粉和玉米漿加量在高氏培養基配方中的搖瓶效價

對比各實驗組結果及t值，帶*組即添加玉米漿各實驗組和高氏I號斜面組的平均效價低于麩皮斜面組，且t值均大于t界值表中相應的 t值2.776 (α =0.05，t0.05/2，4)，其差異具有顯著性，可認為添加玉米漿不利于泰樂菌素菌種培養，故在后續添加實驗中舍去玉米漿各組。對豆餅粉和酵母膏粉的添加劑量和培養周期進行正交設計，以確定最佳組合。

2.2 對高氏I號斜面培養基基礎配方中添加不同比例的豆餅粉(A)、酵母膏粉(B)及斜面孢子培養周期(C)按正交設計L25(56)進行優化，正交設計表如表2。正交實驗結果如表3。

表2 因素水平表

表3 正交實驗結果

表3的實驗結果表明，19號實驗搖瓶效價最高，平均達到13959 u/mL，豆餅粉對搖瓶效價的影響比較大，為主要因子。通過直觀分析得出，斜面孢子培養基最優配方和最佳培養周期為:A4B2C3，高氏I號培養基在基礎配方中添加1.0%豆餅粉和0.2%酵母膏粉，斜面培養至9 d效價最高，斜面孢子生長均勻，壓片鏡檢孢子量大，大部分成游離孢子。

2.3 在培養至第9 d，分別對麩皮斜面和優化后的高氏I號培養基上的菌種進行壓片，經美蘭染色后進行顯微鏡觀察(放大倍數:1000×)，發現在優化后的高氏I號培養基上菌種成熟度明顯好于麩皮培養基，產生了大量的游離單孢子和鏈狀孢子，而麩皮培養基上仍為氣生菌絲。如圖1。

圖1 兩種培養基上菌種壓片鏡檢圖

3 討論

在高氏I號培養基基礎配方中添加1.0%豆餅粉和0.2%酵母膏粉，能夠明顯改善原高氏I號培養基生長慢的現象，使斜面生長周期縮短至9 d，產生大量優質的孢子，夠達到麩皮培養基的菌體生長的速度，而且搖瓶效價高于麩皮培養基斜面。同時其制備過程中簡單，原材料質量容易控制，有利于生產的穩定。優化后的高氏I號培養基完全可替代麩皮培養基用于生產。

［1］田國泰.泰樂菌素在畜禽業上的應用［N］.中國畜牧水產報，2001-03-04:第7版.

［2］史小麗.泰樂菌素的性能與應用［N］中國畜牧水產報，2001-09-30:第4版.

［3］ 張紹鏞，嚴圣武，等.質量管理中的試驗設計方法［M］.北京:北京理工大學出版社，1991:32-119.

［4］石彥鵬，張 麗，張 萍.硫酸亞鐵對泰樂菌素發酵的影響［J］.中國獸藥雜志［J］，2009，43(6):30-31.