CO2及溫度對顯微活細胞培養(yǎng)系統(tǒng)動態(tài)觀察活細胞Ca2+變化的影響

吳偉全，李元歌，王思捷，王永存，吳 平

(1、廣東醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 湛江 524001；2、廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院放射科，廣東 湛江 524001；3、廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，廣東 湛江524001)

隨著生物醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展，通過激光掃描共聚焦顯微鏡動態(tài)觀察活細胞內(nèi)離子變化，特別是鈣離子，是目前研究的熱點[1]。而動態(tài)觀察活細胞內(nèi)離子變化實驗研究中，通過維持最佳CO2及溫度條件去維持細胞活性狀態(tài)尤為關(guān)鍵。但是目前活細胞內(nèi)離子變化動態(tài)觀察中，CO2及溫度條件改變對活細胞活性狀態(tài)產(chǎn)生影響尚不完全清楚。本實驗通過顯微活細胞培養(yǎng)系統(tǒng)改變CO2及溫度條件，探討CO2及溫度對動態(tài)觀察活細胞Ca2+變化的影響，為活細胞動態(tài)觀察實驗研究中維持最佳CO2及溫度條件提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料、主要儀器及試劑 活細胞A549為本實驗室保存。激光掃描共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)；顯微活細胞培養(yǎng)系統(tǒng)(德國IncubatorS-2、CTIController 3700 digital、Tempcontrol 37-2 digital)；35 mm NEST激光共聚焦培養(yǎng)皿 (耐思生物科技有限公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司)；新生小牛血清(民海生物公司)；青霉素-鏈霉素雙抗試劑(杭州吉諾公司)；0.25%胰酶 (Trypsin)-0.02%EDTA溶液 (杭州吉諾公司)；PBS緩沖液(武漢博士德公司)；Fluo-4/AM 熒光染色劑(美國Invitrogen公司)。

1.2 活細胞A549的激光共聚焦培養(yǎng)皿培養(yǎng) 人肺上皮細胞株A549細胞接種于35 mm NEST激光共聚焦培養(yǎng)皿，培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)液中,其中含小牛血清10%、青霉素(100 mg/L)和鏈霉素(100 mg/L),置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中無菌培養(yǎng)。第二天細胞長滿70%～80%皿底可用于活細胞動態(tài)觀察。

1.3 顯微活細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的建立 將顯微培養(yǎng)器IncubatorS-2安置于激光掃描共聚焦顯微鏡的鏡頭上，IncubatorS-2與溫度控制裝置Tempcontrol 37-2 digital及CO2控制裝置CTI-Controller 3700 digital管道聯(lián)通，CTI-Controller 3700 digital再與CO2鋼瓶管道聯(lián)通，建立顯微活細胞培養(yǎng)系統(tǒng)[2]。

1.4 CO2及溫度的控制和實驗分組 CO2及溫度可以通過CTI-Controller 3700 digital和Tempcontrol 37-2 digital正常工作進行控制。細胞分為A組：5%CO2維持37℃溫度正常實驗組、B組：無CO2但維持37℃溫度組和C組：5%CO2室溫溫度組三個組，每組重復(fù)3次。

1.5 活細胞Ca2+變化的動態(tài)觀察 將各組細胞培養(yǎng)于35 mm激光共聚焦培養(yǎng)皿中間的圓形凹槽里。染色前吸除培養(yǎng)皿的培養(yǎng)液，用PBS洗2～3次；向培養(yǎng)皿中輕輕滴入Fluo-4/AM工作液200μl，使其覆蓋凹槽里全部細胞；37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min；吸除染液，用PBS洗2～3次；再用800μl的DMEM高糖培養(yǎng)液覆蓋凹槽里全部細胞，將激光共聚焦培養(yǎng)皿放在顯微培養(yǎng)器IncubatorS-2里，加H2O2后，用激光掃描共聚焦顯微鏡動態(tài)觀察Ca2+的變化。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量數(shù)據(jù)用±s表示，采用方差分析(One-Way-ANOVA)，多樣本均數(shù)比較選用LSD法、Dunnett法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 顯微活細胞培養(yǎng)系統(tǒng)能有效控制活細胞的CO2及溫度 顯微培養(yǎng)器IncubatorS-2、溫度控制裝置 Tempcontrol 37-2 digital和 CO2控制裝置CTI-Controller 3700 digital三者結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡，建立的顯微活細胞培養(yǎng)系統(tǒng)能有效控制CO2及溫度，正常情況下可以維持活細胞的5%CO2及37℃溫度，以維持活細胞較好的狀態(tài)(見圖1、圖 2)。

圖1 CO2控制裝置CTI-Controller 3700 digital

圖2 溫度控制裝置Tempcontrol 37-2 digital

2.2 CO2及溫度對活細胞A549內(nèi)Ca2+變化的影響細胞內(nèi)Ca2+變化結(jié)果見圖3、圖4、圖5和表1。A549細胞內(nèi)可見鈣離子表達，表現(xiàn)為綠色熒光，其強弱反映細胞內(nèi)鈣離子濃度高低。A組A549細胞呈長梭形，狀態(tài)較好，加H2O2后熒光強度從2 min到5 min內(nèi)隨著時間的延長逐步增強(P<0.05)；B組A549細胞大部分呈長梭形，狀態(tài)一般，加H2O2后熒光強度從1 min到5 min內(nèi)隨著時間的延長逐步減弱 (P<0.05);C組A549細胞大部分呈長梭形，狀態(tài)一般，加H2O2后熒光強度從2 min到5 min內(nèi)隨著時間的延長逐步減弱 (P<0.05)。與A組的 比較，B 組 1 min、 2 min、3 min、4 min 和 5 min時間點熒光強度分別減弱(P<0.05)；與A組的比較，C 組 2 min、3 min、4 min 和 5 min 時間點熒光強度分別減弱(P<0.05)。

3 討論

圖3 A組A549細胞內(nèi)Ca2+變化的動態(tài)觀察

圖4 B組A549細胞內(nèi)Ca2+變化的動態(tài)觀察

圖5 C組A549細胞內(nèi)Ca2+變化的動態(tài)觀察

表1 三組A549細胞不同時間點熒光強度比較

激光掃描共聚焦顯微鏡是80年代發(fā)展起來的一項劃時代意義的高科技新產(chǎn)品，它是在熒光顯微鏡成像基礎(chǔ)上加裝了激光掃描裝置，激發(fā)熒光探針，從而得到細胞的熒光圖象，在亞細胞水平上觀察諸如Ca2+、膜電位等生理信號及細胞形態(tài)的變化，成為生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中強有力的研究工具[3]。本院臨床醫(yī)學(xué)研究中心配置是德國Leica TCSII激光掃描共聚焦顯微鏡，具有活細胞動態(tài)觀察成像、多重熒光分離及重組成像和三維重構(gòu)成像等功能。另外通過顯微培養(yǎng)器IncubatorS-2、溫度控制裝置Tempcontrol 37-2 digital和 CO2控制裝置CTI-Controller 3700 digital三者結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡，建立的顯微活細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，實驗結(jié)果表明其能有效控制CO2及溫度。

細胞內(nèi)鈣作為第二信使對細胞生長分化起著重要作用，而目前用于監(jiān)測細胞內(nèi)游離鈣的方法少之又少，激光掃描共聚焦顯微鏡的誕生為人們提供了一種有效工具[4]。研究表明10μM H2O2對細胞內(nèi)游離鈣的刺激在短時間內(nèi)是上升的[5]。本實驗對照組A組在5%CO2維持37℃溫度時，活細胞動態(tài)觀察結(jié)果顯示10μM H2O2對A549細胞內(nèi)游離鈣的刺激在短時間內(nèi)也是上升的，與相關(guān)研究一致。

CO2是細胞培養(yǎng)生存必需條件之一。細胞培養(yǎng)時一般把細胞置于95%空氣加5%二氧化碳混合氣體環(huán)境中。CO2既是細胞代謝產(chǎn)物，也是細胞生長繁殖所需成分它在細胞培養(yǎng)中的主要作用在于維持培養(yǎng)基的pH值[6]。溫度對細胞培養(yǎng)的有重要意義。維持培養(yǎng)細胞旺盛生長，必須有恒定適宜的溫度(維持37℃)。溫度上升不超過39℃時，細胞代謝與溫度成正比；41℃1 h，細胞器結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，細胞線粒體損傷，大部分細胞調(diào)亡；當溫度在43℃以上1h，細胞全部死亡[7]。而低溫對細胞也有一定影響，細胞處在4℃～36℃之間，細胞的代謝速度會減慢[8]。因此，本實驗作為對照組A組是采用CO2及溫度是5%CO2維持37℃，結(jié)果顯示活細胞A549呈長梭形，狀態(tài)較好。

本實驗中通過溫度控制裝置Tempcontrol 37-2 digital及CO2控制裝置CTI-Controller 3700 digital改變溫度及CO2，探討CO2及溫度對動態(tài)觀察活細胞Ca2+變化的影響。實驗結(jié)果顯示B組在無CO2但維持37℃溫度時，活細胞A549大部分呈長梭形，狀態(tài)一般，加藥物后熒光強度從1 min到5 min內(nèi)隨著時間的延長逐步減弱；與對照組比較，其 1 min、 2 min、3 min、4 min和 5 min時間點熒光強度分別減弱。實驗結(jié)果顯示C組在5%CO2室溫溫度時，活細胞A549大部分呈長梭形，狀態(tài)一般，加藥物后熒光強度從2 min到5 min內(nèi)隨著時間的延長逐步減弱。與對照組比較，其2 min、3 min、4 min和5 min時間點熒光強度分別減弱。實驗結(jié)果表明CO2及溫度改變對動態(tài)觀察活細胞Ca2+有較大的影響，實驗結(jié)果B組及C組的活細胞由于CO2或溫度的改變，活細胞狀態(tài)一般，動態(tài)觀察中可能發(fā)生熒光淬滅，因此熒光逐步減弱。而A組活細胞A549呈長梭形，狀態(tài)較好，因此維持5%CO2及37℃為活細胞動態(tài)觀察實驗中CO2及溫度的最佳條件。

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