重組人血管內皮抑制素促進肺癌細胞共培養體系中血管內皮細胞的凋亡機制研究

陳小平 張 茜

（連云港市第二人民醫院，江蘇 連云港 222023）

重組人血管內皮抑制素注射液(Endostar, 恩度)是一種新型的多靶點的血管內皮生長抑制劑，能有效的抑制腫瘤血管的生成，臨床用于多種腫瘤的治療[1]。研究顯示，恩度能特異性的作用于腫瘤微血管內皮細胞，抑制血管生成，抑制腫瘤的生長、侵襲、遷移。隨著環境污染的加重(如PM2.5、PM10.0)、吸煙等因素的影響[2]。肺癌已占據腫瘤患者的發生率和病死率的首位。在臨床治療中，恩度常用于肺癌的治療。目前文獻報道多集中對恩度調控血管內皮生長因子(VEGF)、促血管生成素1、2(Ang1、2)、成纖維細胞生長因子(FGF)等表達的影響[3]。但對血管內皮細胞凋亡的研究較少。因此，在本研究中，將建立非小細胞肺癌細胞A549細胞和人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)體外共培養體系，探討恩度對內皮細胞凋亡的影響及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人非小細胞肺癌A549細胞株、人臍靜脈內皮細胞HUVECs(中國科學院上海細胞庫)；超凈工作臺 (ESCO公司，新加坡)；二氧化碳培養箱(長沙長錦科技有限公司，湖南)；RPMI1640和DMEM培養基(GIBCO)、胎牛血清(杭州四季青公司，批號：110213)、重組人血管內皮抑制素 (恩度): 煙臺麥得津生物工程有限公司；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽 (MTT)(美國,Sigma公司)；Transwll遷移小室(直徑6mm，孔徑5μm，Corning)；Bax，Bcl-2抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。O-(氯乙酰-氨甲酰基)煙曲霉醇(TNP-470，日本Osaka Takeda公司產品)。AnnexinV2FITC凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物公司)。鏈霉親和生物素酶復合物(SABC)試劑盒購自武漢博士得。酶聯分析儀為SPECTRAmax190 (Moleculor Devices, USA)；熒光顯微鏡 (Olympus IX71倒置熒光顯微鏡奧林巴斯BX51，日本)。其余試劑為商業來源的分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 A549細胞和HUVECs細胞共培養體系的建立

取對數生長期的A549和HUVECs細胞，分別以0.25%胰酶-0.01%EDTA消化，加入RPMI-1640培養基分別制備成2×104細胞/mL的A549單細胞懸液和1×105細胞/mL的HUVECs單細胞懸液，將6孔板Transwell 小室的下室接種上HUVECs，上室接種上A549細胞，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基 (100 U/mL青霉素和 100 U/mL鏈霉素培養)，以保證上室的細胞培養在培養基中。將Transwell板置于37℃ 5%CO2培養箱中培養。

1.2.2 恩度共培養體系中對HUVECs生長抑制作用

待下室HUVECs長至75%～85%融合度時，將細胞以含藥培養基處理。恩度的濃度分別為10、20、40、80、100μg/mL，空白對照組加100μL培養基代替，陽性對照組以TNP-470(終濃度25μg/mL)，另設本底對照孔(等體積含相應濃度藥物的無細胞培養液)，每組設3個平行孔。待孵育48h后，棄去每孔的含藥血清，重新加入1mL不含血清的培養基，另加入MTT液(5 mg/mL)20μL，培養箱中孵育4h，棄去液體，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)100μL，于震蕩器中振蕩10min，酶聯免疫檢測儀580nm波長測定OD值。生長抑制率按以下公式計算。實驗重復3次。

細胞生長抑制率=(對照組OD值—實驗組OD值)/對照組OD值×100%

1.2.3 流式細胞術測定HUVECs凋亡

按1.2.2項下接種細胞，并給予藥物。藥物處理并培養48h后，根據下述步驟采用Annexin V-FITC試劑盒測定細胞凋亡：將下室HUVECs細胞以胰酶-EDTA消化，收集細胞，以培養基終止消化。每個樣本至少計數1×104細胞。將收集的細胞以冷的 PBS潤洗2遍，以500μL結合緩沖液懸浮細胞，加入5μLAnnexin V- FITC，輕微混勻；測定前加入5μLPI并置于暗處避光反應15min。上機測定。每組平行2個樣本。

1.2.4 免疫細胞化學檢測恩度對HUVECs中Bcl-2和Bax凋亡蛋白的影響

以鏈霉親和生物素酶復合物(SABC)方法評價恩度對共培養體系中HUVECs的Bax和Bcl-2蛋白表達的影響。HUVECs接種在玻片上。恩度的濃度為10、20和40μg/mL。其他細胞接種和給藥同1.2.2項下操作。待培養48 h后，細胞用PBS洗3次，每次1min；4%多聚甲醛室溫下固定90min，PBS 清洗標本 3次，每次2 min；0.5% Triton X-100孵育20min，PBS洗滌3次，每次2min；以H2O2處理30min；PBS 洗滌3次，每次2min；然后以10%封閉血清孵育37℃20min。加入Bcl-2(1∶200)和Bax(1∶200)抗體37 ℃下孵育；120min后，加入二抗，孵育20min；PBS洗滌，以SABC溶液處理樣本。最后，以3，3'-二氨基聯苯胺(DAB，0.3mg/mL)處理，鏡下控制反應時間，蘇木素輕度復染，PBS洗滌，中性樹膠封片。鏡下Image-ProPlus圖像分析軟件拍片。陰性對照組以PBS替代一抗。

1.2.5 Western blotting檢測Bcl-2和Bax蛋白

細胞接種和給藥同1.2.4項下操作。以胰酶-EDTA消化并收集細胞，加入冰冷PBS潤洗3次，然后加入400μL 裂解液，置于冰上裂解細胞30min。于4℃離心機中14000rpm 離心5min，提取上清液，測定蛋白質濃度后，進行SDS-PAGE轉膜。以含5%牛血清白蛋白(BSA)的TBST室溫下封閉1h，加入Bcl-2與Bax抗體，4℃搖床過夜。加入HRPIgG 二抗(1∶1000)雜交，洗膜后顯色。置于凝膠成像系統中分析Bax和Bcl-2蛋白的相對表達量。

1.2.6 統計學處理

采用SPSS 16.0統計軟件統計分析。所有數據均以均數±標準差(±s)。以One-way ANOVA方差分析對各組數據進行組間差異比較。P＜0.05被認為有統計學意義。

2 結 果

2.1 恩度抑制內皮細胞增殖

恩度對HUVECs生長抑制率隨著濃度的升高逐漸升高，10μg/mL恩度的生長抑制率為(8.19±2.04)%，100μg/mL恩度的生長抑制率為(65.13±3.78)%。陽性對照25μg/mLTNP-470對HUVECs的生長抑制率為37.56±7.22%(表1)。結果表明，恩度具有較強的抑制HUVECs細胞增殖活性。

表1 恩度對HUVECs增殖抑制作用

2.2 恩度誘導內皮細胞凋亡

恩度處理48h后，10、20、40、80、100μg/mL濃度的恩度的凋亡率分別為(5.29±1.21)%、(8.33±0.62)%、(14.81 ±0.77)%、(21.87±0.96)%、(26.15±1.06)%(表2)。研究結果表明，在A549與HUVECs共培養體系中，恩度對HUVECs 細胞具有誘導凋亡作用。

表2 恩度誘導HUVECs細胞凋亡率 (n=3)

2.3 免疫細胞化學測定恩度調節凋亡蛋白表達

在給予10、20、40 μg/mL 恩度48h后，促凋亡蛋白Bad蛋白表達分別為（5.57±1.74）%、（6.26±2.34）%和（8.16±1.58）%；抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達分別為（12.33±2.18）%、（8.67±1.55）%和（6.39±2.14）%(表3)。結果表明，在共培養體系中，恩度上調促凋亡蛋白Bax的表達，而降低抑凋亡蛋白Bcl-2的表達。

表3 恩度對HUVECs中Bcl-2和Bax蛋白表達的影響 (n=3)

2.4 凋亡蛋白的Western blotting測定

Western blotting檢測結果表明，10、20、40μg/mL恩度對抑凋亡蛋白Bcl-2相對表達量分別為（0.46±0.06）%、（0.34±0.07）%、（0.27±0.05）%；對促凋亡蛋白Bax相對表達量分別為（0.25±0.09）%、（0.36±0.12）%、（0.48±0.11）%(表4)。實驗組與空白組相比有統計學差異(P＜0.05)。

表4 Western blotting測定恩度對HUVECs中Bcl-2和Bax蛋白表達的影響 (n=3)

3 討 論

據世界衛生組織統計數據顯示，隨著環境污染的逐漸嚴重以及吸煙等因素的影響，肺癌的發生率和病死率已經占據腫瘤的首位，嚴重威脅人類健康和生存質量。在臨床中，肺癌常發生轉移引發其他腫瘤。而在肺癌的發展與轉移等生物學行為都依賴新血管的生成。研究顯示，當瘤塊及其轉移灶生長至1～2mm以上時，需要進一步生長和轉移，需要新生毛細血管提供氧和營養[4]。因此，通過抑制肺癌的血管生成成為抑制肺癌轉移、抑制癌組織生長的有效措施。

近些年來，被稱為“腫瘤饑餓療法”的抗腫瘤血管生成成為抑制肺癌瘤塊生長、轉移的有效途徑。恩度是國內首例重組人血管內皮抑制素，是通過抑制血管內皮細胞遷移來抑制腫瘤新生血管形成。目前，研究最多的是抑制血管內皮的生長因子如VEGF等的表達以及抑制內皮細胞的遷移。眾多研究表明，誘導內皮細胞凋亡也是抑制血管生成的一個重要機制[5，6]。在本研究中，建立人非小細胞肺癌A549細胞與人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)共培養體系，探討恩度誘導HUVECs凋亡的作用及機制。本研究的結果顯示，在共培養體系中，恩度能顯著抑制HUVECs的增殖，并促進HUVECs的凋亡。

Bcl-2家族蛋白在血管內皮的凋亡中扮演著重要的作用。Bcl-2家族包括抑凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax、Bad等。在正常細胞內，抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白體系處于相對平衡狀態；但當在處于因素的刺激下，這種平衡被打破，抑凋亡處于下調狀態，而促凋亡蛋白處于上升狀態[6]。本研究顯示，當給予血管內皮抑制劑恩度48h后，抑凋亡蛋白Bcl-2被顯著下調，而促凋亡蛋白Bax被顯著上調。結果表明，在共培養體系中，恩度能通過調節凋亡因子促進血管內皮凋亡而抑制血管內皮的生長。

總之，我們的研究探討了恩度抑制血管內皮生長的凋亡機制。這為恩度在臨床上的進一步使用提供實驗依據。

[1]李忠義,劉江秋,徐璐,等.重組人血管內皮抑制素對小鼠Lewis肺癌腫瘤抑制作用[J].中國腫瘤生物治療雜志,2003,10(4): 274-276.

[2]王玉彬,李迪諾,岳莉.重組人血管內皮抑制素對人胃癌MGC-803細胞株VEGF表達的影響[J].江蘇醫藥, 2011,37(13): 1504-1506.

[3]殷宗寶,王洪武,鄧超,等.重組人血管內皮抑制素注射液對低O2高CO2肺動脈高壓大鼠IL-6,eNOS,VEGF 的影響[J].實用醫學雜志,2010,26(18): 3311-3313.

[4]Folkman J.Tumor angiogenesis: therapeutic implications[J].N Engl J Med,1971,285(21):1182-1186.

[5]許成云,倪慶桂,樊馨,等.重組人血管內皮抑制素對肺微血管內皮細胞增殖及其周期分布的影響[J].臨床腫瘤學雜志,2009,14(5):410-413.

[6]Feng L,Xu YH,Wang SS,Au-Yeung W,et al.Preventative Effects of 4,4'-Diphenylmethane-bis(methyl)Carbamate Isolated from Cortex Mori on Human Umbilical Vein Endothelial Cell Dysfunction Induced by Advanced Glycation End Products[J].Phytother Res,2012,26(3):412-419.