摩爾比對L-賴氨酸/L-甲硫氨酸與L-抗壞血酸Maillard反應產物抗氧化活性的影響

鄧啟輝，鐘存貴，余愛農

（湖北民族學院化學與環境工程學院，湖北恩施445000）

摩爾比對L-賴氨酸/L-甲硫氨酸與L-抗壞血酸Maillard反應產物抗氧化活性的影響

鄧啟輝，鐘存貴，余愛農*

（湖北民族學院化學與環境工程學院，湖北恩施445000）

在L-賴氨酸/L-甲硫氨酸與L-抗壞血酸（Lys/Met-ASA）的模式體系中，研究了反應物摩爾比對Maillard反應產物（MRPs）的抗氧化活性的影響。控制反應物不同摩爾比（Lys/Met與ASA的物質的量之比分別為0∶0.002、1∶5、1∶3、1∶1和3∶1），在140℃下加熱攪拌制得MRPs，以還原力和1，1-二苯基-2-苦基偕腙肼自由基（DPPH·）的清除能力為指標，對其產物抗氧化活性進行分析評價。結果表明：在Lys/Met-ASA體系中摩爾比分別為1∶3和1∶5時，產物的還原力、DPPH自由基的清除能力最大；摩爾比對MRPs的抗氧化活性有著顯著的影響。

L-抗壞血酸，L-賴氨酸，L-甲硫氨酸，Maillard反應，抗氧化活性

Maillard反應產物（MRPs）是食品加工和儲藏過程中自身產生的一類物質，可以認為是天然存在的。研究發現，食品工業上廣泛應用的一些抗氧化劑（如二丁基羥基甲苯、丁基羥基茴香醚、二丁基羥基甲苯和生育酚等）可能具有毒副作用[1]，因此MRPs抗氧化活性的研究成為了當今食品工業研究中的熱門課題。L-抗壞血酸（ASA）廣泛存在于植物性食品，如水果蔬菜以及動物食品（如牛乳和肝）中，可熱降解形成糠醛等醛基化合物[2]，所以在食品化學中也將ASA與氨基酸等的反應歸屬于Maillard反應。Maillard反應機理十分復雜，反應歷程、產物組成及其性質受多種因素影響。研究發現，摩爾比對Maillard反應有著很大的影響，Matmaroh等人[3]在果糖-甘氨酸體系中研究了反應物摩爾濃度對抗氧化活性的影響；Sumaya-Martinez等人[4]在糖-金槍魚胃的水解物體系中研究了糖的濃度對褐變強度和1，1-二苯基-2-苦基偕腙肼自由基（DPPH·）清除能力的影響；王惠英等人[5]在賴氨酸（Lys）-核糖體系中對Lys的氨基與核糖的羰基的物質量之比分別為1∶1、1∶2和2∶1的三個體系的MRPs的抗氧化活性進行了研究；尹姿等人[6]在木糖-甘氨酸體系中研究了摩爾比對MRPs抗氧化活性的影響；Rogacheva等人[7]在ASA-甘氨酸體系中研究了不同摩爾比對形成類黑精結構的影響，但沒對其抗氧化活性的影響進行研究。通過對Lys/L-甲硫氨酸（Met）-ASA體系受時間和pH因素影響的研究發現，Lys/Met-ASA體系的最佳反應pH為5，最佳反應時間分別為120min和200min，所以本文擬在Lys/Met-ASA體系優化的條件下對其MPRs的抗氧化活性受摩爾比的影響進行研究，為找到新型的抗氧化劑以及ASA的MRPs的抗氧化活性在今后的食品加工與儲存過程中得到充分利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Lys、Met 上海源聚生物科技有限公司；菲洛嗪、DPPH Sigma公司；ASA、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化亞鐵、三氯化鐵、甲醇等試劑 分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

PHSJ－3F型pH計 上海精密科學儀器有限公司；UV－2501紫外分光光度計 日本島津公司；P170005厚壁耐壓反應瓶 北京欣維玻璃儀器有限公司；MWCO500型透析袋 武漢鑫思銳科技有限公司。

1.2 實驗方法

根據文獻[8]略加改動，將ASA溶解于10.0mL 0.2mol/L Na2HPO4－NaH2PO4緩沖液中，再用NaOH調pH至5，裝入48mL P170005厚壁耐壓反應瓶中，同時按比例（Lys/Met與ASA的物質的量之比分別為0∶0.002、1∶5、1∶3、1∶1和3∶1，并保持反應物總濃度為0.2mol/L）加入Lys/Met，密封，在140℃下攪拌反應120min/200min，快速冷卻至室溫后，用MWCO500透析袋進行透析至ρASA≤1.0μg/mL，定容至50mL，放至4℃冰箱中保存備用。以上樣品均制備平行樣，所有測定值均設二次重復，取平均值。

1.3 測定紫外吸光度和棕色指數

根據文獻[9]中的方法，取反應液1.0mL，加入3.0mL二次蒸餾水，分別在294nm和420nm下，用1cm光程長的吸收池測定其吸光度。

1.4 還原力的測定

根據文獻[9]的方法并略加改動，取反應液0.5mL，加入1.0mL 0.2mol/L磷酸鈉緩沖液（pH6.6）和1.0mL 1%的鐵氰化鉀，混勻，在50℃的水浴中加熱10min，然后加入1.0mL 10%的三氯乙酸。在室溫下離心分離10min，取上清液0.5mL加入2.0mL去離子水和0.2mL 0.1%FeCl3，靜置15min。用蒸餾水代替1%的鐵氰化鉀作為空白，在700nm處測定吸光度。用700nm處測定的吸光度減去空白來表示還原力的大小。

1.5 DPPH自由基清除能力的測定

根據文獻[9]的方法并略加改動，取反應液0.1mL，加入0.9mL二次蒸餾水和3.0mL 0.1mmol/L DPPH甲醇溶液，劇烈混合均勻，在室溫下（記錄室溫）避光靜置30min。在517nm處測定吸光度Asample(517nm)，并以1.0mL二次蒸餾水代替樣品加3.0mL DPPH甲醇溶液作為對照物吸光度Acontrol(517nm)。測定溫度控制在30℃以下。樣品清除DPPH·的能力用DPPH·的百分清除率表示。

清除率（%）=（1－Asample(517nm)/Acontrol(517nm)）×100%

2 結果與討論

2.1 摩爾比對紫外吸光度（A294）的影響

紫外吸光度（A294）表示Maillard反應的高級階段通過Strecker裂解等過程產生的酮、醛類等無色小分子中間體的吸光強度[3]。摩爾比對紫外吸光度（A294）的影響見圖1（相對標準偏差P≤0.05），從圖1可以看出，Lys/Met－ASA的MRPs的紫外吸光度在摩爾比分別為1∶3和1∶5時達到最大，隨著L－抗壞血酸摩爾比的減小，紫外吸光度也減小。結果表明：摩爾比對Lys/ Met－ASA的Maillard反應所生成的無色小分子中間體有著顯著影響，體系摩爾比分別為1∶3和1∶5時所生成的無色小分子中間體最多，而這些大量的無色小分子中間體大部分都來自于Lys/Met－ASA所發生的Maillard反應。這可能是由于ASA在不同濃度下降解產物中羰基化合物種類和數量不同所致[7]。

圖1 摩爾比對Maillard反應產物紫外吸光度的影響Fig.1 Effect of molar ratio on UV absorbance of MRPs

2.2 摩爾比對褐變強度（A420）的影響

Maillard反應產物在420nm處的吸光度通常用來表征Maillard反應的褐變強度[9]。圖2描述了Maillard反應褐變強度隨摩爾比的變化情況（P≤0.05）。從圖2可以看出，Lys/Met－ASA的MPRs的褐變強度在摩爾比分別為1∶3和1∶5時達到最大，之后隨著ASA的物質量的減小，褐變強度也減小，這可能是因為：a.ASA在不同濃度下降解產物中羰基化合物種類和數量不同所致[7]；同時文獻[10]報道了在半乳糖－甘氨酸和葡萄糖－甘氨酸體系中的褐變率也取決于還原糖的濃度；b.過量的氨基酸因受熱引起分子內脫水生成內酰胺，從而使得系統中氨基酸的物質量降低，減緩了褐變速率[5]。文獻[3，11]報道了褐變是由于糖焦化和Maillard反應所引起的。

圖2 摩爾比對Maillard反應產物褐變強度的影響Fig.2 Effect of molar ratio on browning strength of MRPs

2.3 摩爾比對Maillard反應產物還原力（A700）的影響

Maillard反應產物的抗氧化活性與還原力密切相關，產物提供的電子與自由基反應，使自由基成為相對穩定的物質，從而阻斷自由基的連鎖反應[12]，測定的吸光度值越大說明其還原力越強。圖3描述了Lys/Met-ASA的MPRs的還原力隨摩爾比變化的情況（P≤0.05），從圖3可以看出，Lys/Met-ASA的MPRs的還原力在摩爾比分別為1∶3和1∶5時達到最大，之后隨著ASA的物質量的減小，還原力也減小。Yoshimura等人[13]報道了Maillard反應產物中的羥基對還原力有著重要的作用；Hodge等人[14]報道了MPRs中的一些中間產物（如氨基還原酮）具有很強的還原力；Yuan等人[2]報道了ASA在酸性條件下的降解產物主要為糠醛、2-糠酸、3-羥基-2-吡喃酮和一種未知化合物；Feather[15]報道了ASA在pH7.0、37℃有氧時的降解生成的產物為甘油醛、蘇糖、木酮（醛）糖、3-脫氧木酮（醛）糖，這些羰基化合物可能與氨基酸中的氨基反應生成氨基還原酮類物質。綜上所述，Lys/Met-ASA體系的反應中可能生成的氨基還原酮類物質是還原力的主要貢獻者。

圖3 摩爾比對Maillard反應產物還原力的影響Fig.3 Effect of molar ratio on reduced power of MRPs

2.4 摩爾比對DPPH自由基清除能力的影響

摩爾比對DPPH自由基清除能力的影響見圖4（P≤0.05），由圖4可以看出，Lys/Met-ASA體系中摩爾比分別為1∶3和1∶5時MPRs的DPPH自由基清除能力達到最大，隨著ASA的物質的量減小，其清除率逐漸下降。這可能是因為Maillard反應在酸性條件下生成的一些小分子（如噻吩、噻唑、噁唑、呋喃等）具有抗氧化活性[16]；另一方面可能是Lys/Met-ASA體系中所生成的大分子物質（類黑精）也具有抗氧化活性。Sumaya-Martinez等人[4]報道了DPPH自由基清除能力與糖的化學結構和濃度有關，Davies等人[17]報道了Maillard反應的反應速率取決于糖的環狀結構轉變成具有還原性的開鏈結構的比例。由此推測，在Lys/ Met-ASA體系中，與糖類物質具有類似結構的ASA所占比例可能是影響MPRs的DPPH自由基清除能力的主要因素。

圖4 摩爾比對Maillard反應產物的DPPH自由基清除能力的影響Fig.4 Effect of molar ratio on DPPH radical scavenging activity of MRPs

3 結論

通過對Lys/Met-ASA體系的MPRs的抗氧化活性的研究發現，摩爾比對Lys/Met-ASA體系的MPRs的抗氧化活性有著顯著的影響，Lys/Met-ASA體系的MPRs的紫外吸光度（A294）和褐變強度（A420）、還原力（A700）、DPPH自由基清除能力在摩爾比分別為1∶3和1∶5時均達到最大。在Lys/Met-ASA體系的反應中可能生成的氨基還原酮類物質是還原力的主要貢獻者；與糖類物質具有類似結構的ASA所占比例可能是影響MPRs的DPPH自由基清除能力的主要因素。但是Lys/Met-ASA體系的Maillard反應是個復雜的反應，其反應機理有待于進一步深入研究。

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Antioxidative activity of Maillard reaction products from L-lysine/ L-methionine and L-ascorbic acid model systems as influenced by molar ratio

DENG Qi-hui，ZHONG Cun-gui，YU Ai-nong*
（School of Chemistry and Environmental Engineering，Hubei University for Nationalities，Enshi 445000，China）

The objective of this investigation was to study the effect of molar ratio on antioxidative activity of Maillard reaction products（MRPs）from the L-lysine（Lys）/L-methionine（Met）-L-ascorbic acid（ASA）model systems.MRPs were prepared by heating the solution containing ASA and Lys/Met adjusted to pH5 at 140℃for different molar ratios（the molar ratios of Lys/Met to ASA 0∶0.002，1∶5，1∶3，1∶1 and 3∶1）.The antioxidative activity of MRPs was evaluated by reducing power，1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl（DPPH·）radical-scavenging activity.The results indicated that reduced power and DPPH·radical-scavenging activity of MRPs derived from Lys/Met-ASA model systems reached a maximum with the molar ratios of 1∶3 and 1∶5，respectively.The molar ratios had marked the influence on the antioxidative activity of MRPs.

L-ascorbic acid；L-lysine；L-methionine；Maillard reaction；antioxidative activity

TS201.2

A

1002-0306（2012）01-0049-04

2010－10－08 *通訊聯系人

鄧啟輝（1975-），男，碩士，研究方向：食品化學。

國家自然科學基金資助項目（20876036）；湖北省高等學校優秀中青年科技創新團隊計劃項目（T200707）。