超高壓協同乳酸鏈球菌素抑制低溫火腿中的耐壓腐敗菌

溫斯穎，韓衍青，方東路，陳 威，吳菊清，徐幸蓮，*

（1.南京農業大學食品科技學院，江蘇南京210095；2.南京農業大學教育部肉品加工與質量控制重點實驗室，江蘇南京210095）

超高壓協同乳酸鏈球菌素抑制低溫火腿中的耐壓腐敗菌

溫斯穎1，韓衍青2，方東路1，陳 威1，吳菊清2，徐幸蓮2，*

（1.南京農業大學食品科技學院，江蘇南京210095；2.南京農業大學教育部肉品加工與質量控制重點實驗室，江蘇南京210095）

為探尋低溫肉制品中耐壓腐敗菌的抑制手段，揭示超高壓和乳酸鏈球菌素之間的協同抑菌效應。以肉制品中典型的耐壓腐敗菌綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌為供試材料，評價二者在1～500μg/mL的乳酸鏈球菌素存在條件下的生長情況，并結合100～600MPa（5min，20℃）的超高壓處理研究不同壓力條件與乳酸鏈球菌素之間的協同增效作用。結果表明：隨著乳酸鏈球菌素添加量的增加，兩種菌的數量急劇降低，當添加量達到200μg/mL時，對二者的抑制程度達到最大；單獨超高壓處理時，綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌分別在400MPa和300MPa的壓力下受到顯著抑制。而超高壓結合200μg/mL乳酸鏈球菌素處理時，二者受到顯著抑制的壓力均降低到100MPa；500MPa，5min，20℃的超高壓條件結合200μg/mL乳酸鏈球菌素處理能夠抑制綠色魏斯菌數達9lg（cfu/mL）。超高壓和乳酸鏈球菌素之間存在顯著的協同作用，乳酸鏈球菌素的添加將會有效降低工業化生產中超高壓的壓力水平。

超高壓，乳酸鏈球菌素，耐壓菌

超高壓處理（high pressure processing，HPP）能夠很好地保持食品原有的色香味型[1]，是目前一項公認的具有發展前景的非熱加工技術。如今超高壓處理食品在日本、韓國、歐美國家均已進入工業化生產，而我國剛剛進入起步階段，各種罐頭制品、果蔬制品以及水產制品均開始了初步嘗試，技術手段亟待成熟，尤其表現在壓力大小的選擇方面。600MPa，12℃，10min的超高壓處理能夠有效改善低溫火腿的貨架期[2]。然而600MPa以及更高的壓力對超高壓設備性能要求比較高，高壓力一方面增加了加工成本，另一方面存在潛在的引起肉品品質指標惡化的風險，比如褪色、軟化以及脂肪氧化等。食品加工過程中一般采用能夠達到殺菌滅酶效果的最小壓力。因此，有效降低壓力水平對于推進超高壓食品工業化生產有重要作用[3]。乳酸鏈球菌素（Nisin）是一種由乳酸乳球菌乳酸亞種合成的細菌素，是目前公認的安全高效天然食品防腐劑。徐勝等[4]發現乳酸鏈球菌素添加濃度在100～200μg/mL范圍內，經超高壓處理的火腿腸持水性、色澤無顯著變化，貨架期有效改善。Elaine等[5]在牛奶抑菌實驗中證實，超高壓和乳酸鏈球菌素結合能夠顯著提高抑菌效果。Dalgaard研究認為，大多數情況下，食品中只有特定腐敗菌（specific spoilage organism，SSO）參與腐敗過程[6-7]。在貯藏過程中，SSO的快速生長繁殖主導了食品的腐敗過程[8]。綠色魏斯菌（Weissella viridescens）和腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）是目前證實的超高壓低溫肉制品中的兩株典型腐敗菌[9-11]，是超高壓處理肉制品中主要分離到的特定腐敗微生物，也是目前低溫肉制品保鮮領域的焦點微生物。本研究以分離自國內低溫火腿中的上述兩株特定腐敗菌綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌[10]為研究對象，以乳酸鏈球菌素和超高壓作為柵欄因子，揭示二者協同處理對兩種菌存活率的影響，為降低工業化生產中的壓力水平，有效延長低溫火腿的貨架期提供理論數據和技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠色魏斯菌（Weissella viridescens）、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides） 由16S rDNA序列比對結果鑒定[10]，并通過Vitek2細菌全自動鑒定儀（法國梅里埃）確認；乳酸鏈球菌素 浙江銀象生物工程有限公司提供；革蘭氏染色液、MRS瓊脂培養基、MRS肉湯培養基 均購自北京陸橋科技有限公司；0.22μm水系微孔濾膜 購自天津東康科技有限公司；125mm×334mm型耐壓包裝袋 購自北京華盾塑料有限公司。

超高壓設備UHPF/2L/800MPa 內蒙古包頭科發高新技術食品機械公司；紫外分光光度計Spectrum723 上海光譜儀器有限公司；超凈工作臺SW-CJ-2FD 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；真空抽濾裝置 EHSY西域中國有限公司；高速冷凍離心機Allegra64R Beckman；生化培養箱SPX-250B-Z 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；立式壓力蒸汽滅菌器LDZX-50KBS 上海申安醫療器械廠；連續點動微型旋渦混合儀WH-2 上海滬西分析儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 生長曲線的建立 采用比濁法[11]建立綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌的生長曲線。具體操作如下：將活化后的菌株按1%～3%的接種量無菌條件下接種到MRS肉湯培養基中，30℃下培養。每隔2h取樣，吸取5mL0.85%的生理鹽水對樣品離心洗脫，重復三次，最后加入5mL生理鹽水重懸菌液，生理鹽水作空白對照，600nm波長下比色，記錄光密度值（OD值），以培養時間為橫坐標，菌懸液OD值為縱坐標，建立生長曲線。

1.2.2 乳酸鏈球菌素耐受實驗 配制0.02%的檸檬酸溶液（pH3～4），以此作為溶劑配制50mg/mL的乳酸鏈球菌素貯存母液，使用0.22μm水系微孔濾膜過濾除菌，置4℃條件下保存備用。

配制MRS瓊脂培養基，待其降至適宜溫度后在無菌條件下加入乳酸鏈球菌素貯存母液，分別調整其濃度為0、1、100、200、300、400、500μg/mL，充分混勻。取培養至穩定期的對象菌，以滅菌的MRS肉湯培養液（pH6.0）洗脫，并調整綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌數量分別至109、108cfu/mL。按照GB/T4789.2-2008操作，以上述添加乳酸鏈球菌素的MRS瓊脂培養基進行傾注培養，培養條件為30℃，48h，評價兩種菌對乳酸鏈球菌素的耐受程度。

1.2.3 超高壓處理 取培養至穩定期的菌體，以上述方法調整綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌數量分別至109、108cfu/mL，將二者的MRS肉湯懸浮液分裝于無菌的聚酰胺/聚乙烯包裝袋，每袋2mL。熱封口，不留頂隙。分別采用0、100、200、300、400、500、600MPa的壓力超高壓處理5min，處理時間不包括升壓和卸壓的時間（傳壓介質為葵二酸二辛酯液壓油）。處理時的油溫為20℃，升壓過程中油溫會上升，約1～2℃/ 100MPa。每組處理設兩個重復，處理完畢樣品放入盛有冰袋的泡沫箱中運回實驗室，按照GB/T4789.2-2008進行平板計數，培養條件同上。

1.2.4 超高壓和乳酸鏈球菌素結合處理 于上述調整好綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌數量的MRS肉湯懸浮液中添加乳酸鏈球菌素至其終濃度為200μg/mL，混合均勻，分裝，每袋2mL，包裝方法同上。每組設兩個重復，分別采用0、100、200、300、400、500、600MPa的壓力進行超高壓處理5min，以未添加乳酸鏈球菌素且未受超高壓處理的樣品作空白對照。按照GB/ T4789.2-2008進行平板計數，培養條件同上。

1.2.5 統計分析 數據統計采用SAS8.12進行ANOVA單因素方差分析及Ducan’s多重檢驗（Plt;0.05），數值以均值±標準差表示。

2 結果與討論

2.1 綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌的生長曲線

圖1顯示了接種后的綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌在MRS肉湯培養過程中的生長變化情況。綠色魏斯菌在接種2h后進入指數生長期，12h后生長速率開始下降，16～18h到達穩定期，此時菌體數量也達到最大，之后進入衰亡期開始下降；腸膜明串珠菌在接種4h后進入指數生長期，培養18h后進入穩定期，22h后進入衰亡期。由二者的生長曲線可見，綠色魏斯菌的延遲期相對較短，短時間內數量增加到最大。大多數的研究表明，綠色魏斯菌適應環境的能力比較強，是一種既能耐受熱處理又能耐受超高壓處理，同時還能耐受低濃度有機酸處理的腐敗微生物[9-10，12]。依據生長曲線結果，確定綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌的穩定生長期分別為培養16～18h和培養18～22h，以下抑菌實驗均使用此時間段菌株作為對象菌種。

圖1 綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌的生長曲線Fig.1 Growth curves of W.viridescens and L.mesenteroides

2.2 乳酸鏈球菌素耐受實驗

綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌對乳酸鏈球菌素的耐受程度見圖2。隨著乳酸鏈球菌素添加濃度的升高，綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌生長受到的抑制強度增大。腸膜明串珠菌對乳酸鏈球菌素的耐受性較差，200μg/mL的乳酸鏈球菌素能夠使該菌數量降低8lg（cfu/mL）；而綠色魏斯菌的耐受性較強。當乳酸鏈球菌素含量上升至200μg/mL后，抑制程度不再發生顯著變化，近4lg（cfu/mL）的綠色魏斯菌存活。

由于能夠改變革蘭氏陽性菌細胞膜的通透性而導致細胞自溶死亡[13-14]，乳酸鏈球菌素在食品特別是肉品中的應用非常廣泛。綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌均屬于革蘭氏陽性菌，由圖2可知，乳酸鏈球菌素對二者表現出較強的抑制效果，尤其是對腸膜明串珠菌。然而，綠色魏斯菌仍有近4lg（cfu/mL）的存活，說明綠色魏斯菌對乳酸鏈球菌素存在一定的耐受性，即使在500μg/mL的乳酸鏈球菌素濃度下，綠色魏斯菌仍然能夠生長繁殖。

圖2 不同濃度乳酸鏈球菌素對綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌的抑制效果Fig.2 Effect of Nisin on inhibition of W.viridescens and L.mesenteroides

2.3 超高壓和乳酸鏈球菌素的協同抑菌效果

表1列出了單獨超高壓處理以及添加200μg/mL乳酸鏈球菌素后超高壓處理的實驗結果。單獨超高壓處理時，綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌數量隨壓力升高均逐漸減少。綠色魏斯菌初始數量為9.04lg（cfu/mL）；壓力升高至400MPa時，開始顯著減少，近4lg（cfu/mL）受到抑制；繼續升高壓力至500MPa和600MPa時，綠色魏斯菌均表現出顯著減少的趨勢，在最高壓力600MPa時，綠色魏斯菌數量下降至2.35lg（cfu/mL）。腸膜明串珠菌對壓力的耐受性較差，壓力升高至300MPa時開始顯著減少，繼續升高壓力至500MPa時腸膜明串珠菌被完全抑制。添加200μg/mL乳酸鏈球菌素后進行超高壓處理時，綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌數量隨壓力升高而減少的幅度變大，且抑制效果并非簡單的疊加，而是呈顯著的協同作用。乳酸鏈球菌素存在時，綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌受到顯著抑制的壓力均降低到100MPa，二者分別在500MPa和400MPa時達到完全抑制。

表1 超高壓和乳酸鏈球菌素結合處理綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌Table1 The change of inhibition effect after adding Nisin at high pressure processing

綠色魏斯菌是超高壓肉制品中最常分離到的腐敗菌之一，能夠耐受600MPa甚至更高的壓力。Patterson等[15]在研究雞肉制品保藏中發現，綠色魏斯菌在600MPa，18℃，2min處理條件下細菌數量僅有不到1lg（cfu/g）的減小。Diez等[9]的研究表明，綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌是超高壓處理的血腸制品中的優勢腐敗菌。本文的數據證實，分離自低溫煙熏火腿中的綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌同樣能夠耐受超高壓處理，單純超高壓處理無法徹底抑制綠色魏斯菌的生長。

如何有效抑制此類微生物的生長繁殖是學術界和產業界亟待解決的難題。目前報道的抑制手段主要包括超高壓結合熱處理[16]、有機酸[17]以及生物的或天然的抑菌成分[18-19]等。本研究采用超高壓和乳酸鏈球菌素作為柵欄因子，結果表明二者存在明顯的協同增效作用。前人的研究認為[1，20]，超高壓抑制微生物生長主要通過影響微生物細胞膜和細胞功能性蛋白實現。超高壓能夠導致微生物細胞發生不可逆的體積減小，從而引起細胞形態發生異常，細胞膜通透性發生變化，最終導致細胞質及細胞內容物的流失（尤其在壓力保持階段），細胞死亡[21]；另一方面，細胞內大量的聚合蛋白在超高壓作用下發生變性分離，微生物出現受傷或者死亡[22]。乳酸鏈球菌素的存在，導致細胞膜的去極化以及胞內ATP的泄露，加劇了超高壓對細胞膜的作用。本研究證實，超高壓和乳酸鏈球菌素結合處理能夠有效抑制綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌的生長繁殖。

3 結論

超高壓與乳酸鏈球菌素結合處理對分離自低溫火腿中的典型腐敗菌綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌具有顯著的協同抑制作用，200μg/mL的乳酸鏈球菌素結合500MPa，5min，20℃的超高壓處理條件，能夠徹底抑制綠色魏斯菌的生物活性。乳酸鏈球菌素的添加能夠有效降低工業化生產中高壓力水平的使用。

[1]Hugas M，Garriga M，Monfort J M.New mild technologies in meat processing：high pressure as a model technology[J].Meat Science，2002，62：359-371.

[2]韓衍青，張秋勤，徐幸蓮，等.超高壓處理對煙熏切片火腿保質期的影響[J].農業工程學報，2009，25（8）：305-311.

[3]陳韜，周光宏，徐幸蓮.高壓技術在肉制品加工中的作用[J].食品與發酵工業，2003，29（9）：64-68.

[4]徐勝.超高壓和天然抑菌劑對低溫火腿腸保鮮效果的研究[D].合肥：合肥工業大學，2009.

[5]Elaine P，Black E P，Kally A L，et al.The combined effect of high pressure and nisin on inactivation of microorganisms in milk[J].Innovative Food Science and Emerging Technologies，2005，6：286-292.

[6]Gram L，Trolle G，Huss H H.Detection of specific spoilage bacteria from fish stored at low and high temperatures[J]. International Journal of Food Microbiology，1987，4（1）：65-72.

[7]Dalgaard P.Qualitative and quantitative characterization of spoilage bacteria from packed fish[J].International Journal of Food Microbiology，1995，26（3）：319-333.

[8]Dalgaard P.Modeling of microbial activity and prediction of shelf life for packed fresh fish[J].International Journal of Food Microbiology，1995，26（3）：305-317.

[9]Diez A M，Urso R，Rantsiou K，et al.Spoilage of blood sausages morcilla de Burgos treated with high hydrostatic pressure[J].International Journal of Food Microbiology，2008，123：246-253.

[10]Han Y Q，Xu X L，Jiang Y，et al.Inactivation of food spoilage bacteria by high pressure processing：Evaluation with conventional media and PCR-DGGE analysis[J].Food Research International，2010，43：1719-1724.

[11]郭春葉，龔月生，劉林麗，等.酵母菌生長曲線的測定及其轉葡萄芪合酶基因重組菌遺傳穩定性的檢測[J].安徽農業科學，2007，35（7）：1909-1910.

[12]Bjǒrkroth J，Holzapfel W.Genera Leuconostoc，Oenococcus and Weissella[M].The Prokaryotes.Springer New York，2006：267-319.

[13]呂淑霞，白澤樸，代義，等.乳酸鏈球菌素（Nisin）抑菌作用及其抑菌機理的研究[J].中國釀造，2008（9）：87-91.

[14]Engelkeg G，Gutowski-Eckel Z，Hammelmann M，et al. Biosynthesis of the lantibiotic nisin：genomic organization and membrane localization of the NisB protein[J].Applied and Environmental Microbiology，1992，58（11）：3730-3743.

[15]Patterson M F，Mckay A M，Connolly M，et al.Effect of high pressure on the microbiological quality of cooked chicken during storage at normal and abuse refrigeration temperatures[J].Food Microbiology，2010（27）：266-273.

[16]Park S W，Sohn K H，Shin J H，et al.High hydrostatic pressure inactivation of Lactobacillus viridescens and its effect on ultra structure of cells[J].International Journal of Food Science and Technology，2001，36：775-781.

[17]Diez A M，Santos E M，Jaime I，et al.Application of organic acid saltsand high-pressure treatmentsto improve the preservation of blood sausage[J].Food Microbiology，2008（25）：154-161.

[18]Roedriguez E，Arques J L，Nulnez M，et al.Combined effect of high-pressure treatments and bacteriocin-producing lactic acid bacteria on inactivation of Escherichia coli O157：H7 in raw-milk cheese[J].Applied and Environmental Microbiology，2005，71：3389-3404.

[19]Samelis J，Kakouri A，Georgiadou K G，et al.Evaluation of the extent and type of bacterial contamination at different stages of processing of cooked ham[J].Journal of Applied Microbiology，1998，84：649-660.

[20]Smelt J.Recent advances in the microbiology of high pressure processing[J].Trends in Food Scienceamp;Technology，1998（9）：152-158.

[21]Marie J，Corne P，Gervais P.A new design intended tolerate high pressure treatment to yeast cell mass transfer[J].Journal of Biotechnology，1995，41：95-98.

[22]Abe F，Horikoshi K.Tryptophan permeates gene TAT2 confers high-pressure growth in Saccharomyces cerevisiae[J]. Molecular and Cellular Biology，2000（20）：8098-8102.

Combined effect of ultra high pressure and Nisin on inactivation of spoilage pressure-resistant bacteria isolated from smoked cooked ham

WEN Si-ying1，HAN Yan-qing2，FANG Dong-lu1，CHEN Wei1，WU Ju-qing2，XU Xing-lian2，*
（1.College of Food Science and Technology，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China；2.KeyLabofMeatProcessingandQualityControl，MinistryofEducation，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，China）

The objective of this study was to evaluate the cooperate effect between high pressure and nisin content in inactivating pressure-resistant bacteria of cooked meat products.Typical spoilage pressure-resistant bacteria Weissella viridescens and Leuconostoc mesenteroides were treated with addition of 1～500μg/mL Nisin and also subjected to treatment at a range of high pressure from 100 to 600MPa（5min，20°C）.Standard culture methods were used to detecting the number of survivals.Results showed that，with the growing addition of nisin，numbers of the two bacteria were falling rapidly.When nisin content was up to 200μg/mL，these inactivate effect went to maximum.Significant reduction in bacteria numbers was found at high pressure treated at 400MPa and 300MPa for W.viridescens and L.mesenteroides，respectively.However，when high pressure treated with 200μg/mL Nisin，the pressure level fallen to 100MPa both for these two bacteria.High pressure treated at 500MPa for 5min at 20°C，with 200μg/mL Nisin content，could inactivate W.viridescens counts by 9lg（cfu/mL）.It provided evidence that there surely exist combined effect between high pressure and nisin when used for delaying bacteria grows.Nisin addition can effectively lower the pressure level used during industrial decontamination processes.

ultra high pressure；Nisin；pressure-resistant bacteria

TS251.1

A

1002-0306（2012）01-0059-04

2011－02－14 *通訊聯系人

溫斯穎（1991-），女，本科，研究方向：食品科學與工程。

國家大學生創新性實驗計劃課題（101030723）；江蘇省普通高校研究生創新計劃項目（CX10B_310Z）。