不同溶劑提取乳苣的抗氧化作用研究

高義霞，周向軍，楊 聲，劉周龍，王強強

（天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，甘肅天水741001）

不同溶劑提取乳苣的抗氧化作用研究

高義霞，周向軍，楊 聲，劉周龍，王強強

（天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，甘肅天水741001）

以乳苣全草為原料，75%乙醇為溶劑提取乳苣，提取液用不同極性溶劑依次萃取，得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物，同時測定了各相提取物對羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基的清除能力，并與VC進行比較。結(jié)果表明：各萃取物均具有一定的抗氧化活性，且隨著濃度的增加而增強；對羥自由基的清除能力大小依次為乙酸乙酯萃取物＞正丁醇萃取物＞VC＞水萃取物＞石油醚萃取物；對超氧陰離子自由基清除能力大小依次為VC＞正丁醇萃取物＞乙酸乙酯萃取物＞石油醚萃取物＞水萃取物；對DPPH自由基清除能力大小依次為VC＞乙酸乙酯萃取物＞正丁醇萃取物＞水萃取物＞石油醚萃取物；各萃取物還原能力大小依次為VC＞正丁醇萃取物＞乙酸乙酯萃取物＞水萃取物＞石油醚萃取物。

乳苣，活性成分，抗氧化

生物體內(nèi)代謝過程中常發(fā)生氧化還原反應(yīng)，不斷產(chǎn)生自由基，進而引起DNA損傷、酶變性及功能紊亂等。因此適當(dāng)補充外源抗氧化劑可以清除自由基、阻斷脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、預(yù)防和治療病癥等。由于一些人工合成的抗氧化劑如BHT、BHA、TBHQ等被動物實驗證實有毒及人們越來越追求綠色環(huán)保消費，因而尋找安全、天然的抗氧化劑日益成為研究熱點。乳苣（Mulgedium tataricum L.）又名蒙山萵苣、紫花山萵苣、苦菜等，多年生草本植物，分布在俄羅斯、歐洲印度、伊朗、阿富汗及我國東北、華北及西北等地，生長于海拔1200～4300m的地區(qū)，常生長在湖邊、草甸、田邊、河灘、固定沙丘以及礫石地[1]。莖葉可作豬飼料[2]，全草可藥用，用于腸癰、癰種、丹毒、目赤、癖血腹痛、赤白帶等[3]。民間作為野菜采食，有抗菌、消炎、止痛等功效。但因其味苦、植株小而未被充分利用，造成資源浪費。王曉雄等從乳苣全草中分離到三萜類和倍半萜類化合物，并確定了其結(jié)構(gòu)[4－6]。本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)，乳苣全草中含有豐富的黃酮類物質(zhì)[7]。藥理學(xué)表明，作為天然藥物中含量最多、分布最廣泛的活性成分之一——黃酮類物質(zhì)具有抗病毒、抗菌、降壓、抗腫瘤、抗氧化等作用。關(guān)于乳苣活性物質(zhì)的抗氧化研究，目前未見報道。本實驗采用乙醇回流及溶劑萃取相結(jié)合的方法，從乳苣全草中分離到石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相及水相提取物浸膏，并測定了總還原能力、清除羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基的能力，并與VC相比較，評價其抗氧化能力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳苣（Mulgedium tataricum L.） 采自甘肅省白銀市靖遠(yuǎn)縣農(nóng)田和水渠邊，經(jīng)天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院汪之波副教授鑒定為菊科乳苣屬乳苣。乳苣全草，室溫干燥，粉碎，過80目篩，備用；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 購自南京替斯艾么中藥技術(shù)研究所（99%純度）；DPPH（二苯代苦味肼基自由基）、抗壞血酸 Sigma公司；其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

電子天平 北京賽多利天平有限公司；RE－52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；SHZ－D循環(huán)水式真空泵 河南開封宏興科教儀器廠；UV2450紫外－可見分光光度計 日本島津。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳苣不同提取物的制備 取上述制備的乳苣全草粉末60g，置于圓底燒瓶內(nèi)，以1∶40液固比加入75%乙醇，于90℃下回流提取1h，過濾，收集濾液，濾渣重復(fù)以上操作，合并兩次濾液并濃縮至原體積的1/3，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取三次，分別收集各相萃取液，濃縮并冷凍干燥至恒重，得干浸膏并計算得率，測定其總黃酮含量。

1.2.2 不同溶劑提取物清除羥自由基測定 以VC為對照，采用Fenton反應(yīng)測定樣品對羥自由基清除能力[8]。取0.75mmol/L鄰二氮菲溶液1mL，PBS緩沖液（pH7.4）2mL和70%乙醇1mL，充分混勻后，加2.5mmol/L硫酸亞鐵1mL，混勻，加0.1%的過氧化氫2.5mL，37℃保持60min，于波長200～600nm掃描確定最大吸收波長為510nm，測其吸光度，記為Ap。用2.5mL蒸餾水代替2.5mL過氧化氫，得吸光度為Ab。用不同濃度的樣液1mL代替1mL乙醇，吸光度為As。·OH清除率（S1）=[（As－Ap）/（Ab－Ap）]×100%

1.2.3 不同溶劑提取物清除超氧陰離子自由基測定 取0.05mol/L Tris－HCl緩沖溶液（pH 8.2）4.5mL，置于25℃水浴中預(yù)熱20min，分別加入0.1mL不同濃度的樣液和0.4mL 25mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻后于25℃水浴中反應(yīng)5min，加入8mmol/L HCl 1.0mL終止反應(yīng)，于波長200～600nm掃描確定最大吸收波長為299nm，測定吸光度（Ai），空白對照組以相同體積蒸餾水代替樣品，空白樣吸光度（A0），平行進行3次實驗，計算平均值[8]。清除率（S2）=（A0－Ai）/A0×100%

1.2.4 不同溶劑提取物清除DPPH自由基測定 準(zhǔn)確稱取DPPH標(biāo)準(zhǔn)品25mg，95%乙醇定容至250mL，得質(zhì)量濃度為0.1g/L溶液。吸取3mL，加入不同濃度的樣液1mL，搖勻，室溫暗處放置30min，于波長200～600nm掃描確定最大吸收波長為517nm，測吸光度（Ai）。同時測1mL溶劑與3mL DPPH混合后吸光度（Ac），1mL樣品液加3mL乙醇混合后吸光度（Aj）[8]。DPPH·清除率（S3）=[1－（Ai－Aj）/Ac]×100%

1.2.5 不同溶劑提取物還原能力測定 在2.0mL pH6.6 PBS緩沖液中加入不同濃度的樣液1.0mL，0.1%的鐵氰化鉀溶液2.0mL，混合物在50℃恒溫20min后，再加入2.0mL 10%的三氯乙酸溶液，然后以3000r/min離心分離10min，取上層清液2mL，加蒸餾水2mL和0.1%FeCl3溶液0.5mL，靜止10min后，于波長200～600nm掃描確定最大吸收波長為700nm，測定吸光度，吸光度越高，還原能力越強。A為樣品，A0為對照[9]，△A=A－A0。

2 結(jié)果與分析

乳苣乙醇浸膏熱水分散后，經(jīng)石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得石油醚萃取物（PEP）、乙酸乙酯萃取物（EAE）、正丁醇萃取物（BE）和水萃取物（WE），提取率分別為7.33%、1.59%、1.75%、23.57%。分別測定各相浸膏總黃酮含量為5.28%、15.02%、12.6%、9.39%。

2.1 乳苣不同溶劑萃取物對羥自由基的清除率

圖1 不同溶劑提取物對羥自由基的清除率Fig.1 Hydroxyl radical scavenging rate of different solvent extracts

取乳苣不同提取溶劑浸膏，稀釋至一定濃度，測定其清除羥自由基的能力，結(jié)果見圖1。由圖可知，隨樣品濃度的增加，各相提取液對羥自由基的清除力增強。為了評價抗氧化劑的抗氧化性能和自由基的清除能力，常選擇清除率為50%時抗氧化劑的質(zhì)量濃度（EC50）作為評價指標(biāo)，EC50越小，抗氧化劑清除自由基的能力越強[10]，利用SPSS16.0計算出PEP、BE、EAE、WE及VC的EC50分別為79.932、1.9、1.265、4.157、2.657mg/mL。由此可知，以上各項萃取物對羥自由基均有一定的清除作用，清除力強弱順序為EAE＞BE＞W(wǎng)E＞PEP，與VC相比，EAE和BE效果優(yōu)于VC。可推測乳苣EAE和BE具有較好的清除羥自由基作用，且發(fā)揮作用的成分主要在黃酮類提取部位。

2.2 乳苣不同溶劑萃取物對超氧陰離子自由基的清除率

圖2 不同溶劑提取物對超氧陰離子自由基的清除率Fig.2 Superoxide radical scavenging rate of different solvent extracts

取乳苣不同提取溶劑浸膏，稀釋至一定濃度，測定其清除超氧陰離子自由基能力，結(jié)果見圖2。可知隨樣品濃度的增加，各相提取液對超氧陰離子自由基的清除力增強。計算出PEP、BE、EAE、WE及VC的EC50分別為15.697、3.577、7.803、30.246、1.379mg/mL。由此可知，以上各項萃取物對超氧陰離子自由基均有一定的清除作用，清除力依次為BE＞EAE＞PEP＞W(wǎng)E。清除超氧陰離子自由基能力與總黃酮含量呈正相關(guān)，與VC相比，各相萃取物效果次于VC。可推測乳苣EAE和BE具有較好的清除超氧陰離子自由基作用，且發(fā)揮作用的成分主要在黃酮類提取部位。

2.3 乳苣不同溶劑萃取物對DPPH·的清除率

圖3 不同溶劑提取物對DPPH·的清除率Fig.3 DPPH·scavenging rate of different solvent extracts

取乳苣不同提取溶劑浸膏，稀釋至一定濃度，測定其DPPH·的能力，結(jié)果見圖3。可知隨樣品質(zhì)量濃度的增加，各相提取液對DPPH·的清除力增強，計算出PEP、BE、EAE、WE及VC的EC50分別為0.198、0.053、0.052、0.132、0.031mg/mL。由此可知，以上各項萃取物對DPPH自由基均有一定的清除作用，清除力順序為EAE＞BE＞W(wǎng)E＞PEP。清除DPPH自由基能力與總黃酮含量呈正相關(guān)，與VC相比，各相萃取物效果次于VC。可推測乳苣EAE和BE具有較好的清除DPPH自由基作用，發(fā)揮作用的成分主要在黃酮類提取部位。

2.4 還原能力

圖4 不同溶劑提取物的總還原能力Fig.4 Reduction abilities of different solvent extracts from Mulgedium tataricum L.

圖4表明，樣品及陽性對照的還原力強弱與溶液濃度呈正相關(guān)性，即同一樣品提取物濃度越大，則吸光值越大，進而可知其還原力越大；且同一濃度不同樣品線形越陡峭其還原力越大，由圖4可知，還原力大小順序為BE＞EAE＞W(wǎng)E＞PEP。

3 結(jié)論

3.1 以乳苣全草為原料，以75%乙醇為溶劑回流提取，提取液用不同極性溶劑依次萃取，分別得到PEP、EAE、BE和WE，同時測定各相提取物總黃酮依次為5.28%、15.02%、12.6%、9.39%。

3.2 測定各相萃取物清除羥自由基、超氧陰離子自由基、二苯代苦味肼基自由基（DPPH·），并與Vc進行比較，結(jié)果顯示各相萃取物均具有一定的抗氧化活性，隨著濃度的增加而提高；在不同的自由基產(chǎn)生體系中，EAE和BE均具有較好的清除作用，可推測發(fā)揮作用的成分主要在黃酮類提取部位。

[1]中國科學(xué)院中國植物志編寫委員會.中國植物志第80卷（第一分冊）[M].北京：科學(xué)出版社，1997：75.

[2]中國科學(xué)院中國植物編輯委員會.中國植物志[M].科學(xué)技術(shù)出版社，1997：75－76.

[3]江蘇省植物研究所.新華本草綱目[M].第三冊.上海科學(xué)技術(shù)出版社，1990：435.

[4]朱強，梁文裕，王俊.乳苣一新變種—白花乳苣[J].西北植物學(xué)報，2009，29（1）：195－196.

[5]Xiao Xiong WANG，Zhong Jian JIA.Two new lanostane－type triterpenoids from Mulgedium tataricum[J].Chinese Chemical Letters，2006，17（2）：204－206.

[6]Xiao Xiong WANG，Chang Jun LiIN，Zhong Jian JIA. Triterpenoids and sesquiterpenes from Mulgedium tataricum[J]. Planta Medica，2006，72（8）：764－767.

[7]高義霞，景紅艷，姜祖君.響應(yīng)面分析法優(yōu)化乳苣總黃酮提取工藝的研究[J].中藥材，2010，33（4）：621－624.

[8]謝貞建，焦士蓉，唐鵬程.枳實類黃酮體外抗氧化作用研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2009，29（4）：33－36.

[9]張偉敏，肖健雄，符致堅，等.膽木葉提取物的抗氧化活性研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2009，29（4）：82－86.

[10]張偉敏，符文英，李楠，等.諾麗葉化學(xué)成分與提取物抗氧化性質(zhì)研究[J].浙江大學(xué)學(xué)報：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2009，35（5）：543－548.

Study on antioxidant activities of Mulgedium tataricum L. extraction using different solvents

GAO Yi-xia，ZHOU Xiang-jun，YANG Sheng，LIU Zhou-long，WANG Qiang-qiang（College of Life Science and Chemistry，Tianshui Normal University，Tianshui 741001，China）

Using Mulgedium tataricum L.with whole grass as raw material，75%ethanol extraction solvents，the resulting crude extracts were further extracted using different solvents respectively，such as petroleum ether，ethyl acetate，n-butanol and water.And at the same time antioxidant activities of each phase were studied and compared with Vcusing hydroxyl radical system，superoxide radical system and system of DPPH.The results showed that all phases had certain antioxidant activities and the effect was increased with increase of concentration.Scavenging effect were as follows：ethyl acetate extracts＞n-butanol extracts＞Vc＞water extracts＞petroleum ether extracts for hydroxyl radical，Vc＞n-butanol extracts＞ethyl acetate extracts＞petroleum ether extracts＞water extracts for superoxide radical，Vc＞ethyl acetate extracts＞n-butanol extracts＞water extracts＞petroleum ether extracts for DPPH·and the reducing power were as follows：Vc＞n-butanol extracts＞ethyl acetate extracts＞water extracts＞petroleum ether extracts.

Mulgedium tataricum L.；effective components；antioxidation

TS255.1

A

1002－0306（2012）01－0085－03

2010－12－17

高義霞（1982－），女，助教，研究方向：資源植物學(xué)。

天水師范學(xué)院重點學(xué)科支持項目。