莜麥中病程相關蛋白的分離純化及其幾丁質酶活性分析

閆永飛，石亞偉

（教育部化學生物學與分子工程重點實驗室，山西大學生物技術研究所，山西太原030006）

莜麥中病程相關蛋白的分離純化及其幾丁質酶活性分析

閆永飛，石亞偉*

（教育部化學生物學與分子工程重點實驗室，山西大學生物技術研究所，山西太原030006）

病程相關蛋白廣泛存在于高等植物中，可以被多種微生物病原菌誘導產生，是植物抗病物質，具有重要應用前景。以莜麥種子為原料，經丙酮脫脂、硫酸銨鹽析、DEAE離子交換以及Superdex－200層析等方法，獲得一種具有幾丁質酶活性的病程相關蛋白，其在酸性條件下穩定存在，最適pH為5.0，最適反應溫度為45℃，當溫度高于65℃時活性喪失80%。蛋白分子量經測定為23.7ku，為單體蛋白。該蛋白可以抑制白腐菌、毛殼菌的生長，其最低抑制濃度為

30μg/mL；但對紅曲霉沒有效果。

病程相關蛋白，莜麥，純化，特征

Van Loon等1970年首先從煙草花葉病毒（tobaccomosaic virus，TMV）侵染的煙草葉片中檢測到與過敏性反應（HR）相關的蛋白，如葡聚糖酶、幾丁質酶，后來將這些由病原物誘導植物產生的特異性蛋白質統稱為病程相關蛋白（pathogenesis－related proteins，PRP），它們屬于抗真菌蛋白的一種。至今已在7個科30多種植物中發現PRP，其中多數為雙子葉植物，例如番茄[1]、馬鈴薯[2]、菜豆、豌豆、豇豆[3－4]，最近又在野油菜[5]、蕓薹[6]、鷹嘴豆[7]、擬南芥[8]、水稻[9]中分離到病程相關蛋白。PRP在正常植物中不存在或表現微弱，而當植物被病原菌感染或誘導后，則迅速產生并積累。與病原菌本身相關的一些物質同樣可以誘導植物產生PRP，例如幾丁質、β－1，3葡聚糖等[10]。PRP相對分子質量較小，一般為10～40ku，PRP有較強的穩定性，大部分PRP能抵抗蛋白酶、糖苷酶、重金屬、尿素、低pH和高溫（60℃）。不同誘發因子在誘導植物系統中產生的PRP的生物特性各不相同。PRP一般表現一種或幾種活性，如幾丁質酶、β－1，3葡聚糖酶、脫乙酰殼多糖酶、類甜味蛋白（Thaumatin－Like protein，TLP）等。植物體的病程相關蛋白中TLP一類屬于多功能蛋白，不僅具有α－淀粉酶的抑制活力，還有胰蛋白酶的抑制活力以及幾丁質酶的部分活力[4]。本文從山西應縣的莜麥種子中，利用蛋白的分離純化技術，獲得到一種病程相關蛋白，除具有抑制胰蛋白酶活力外，還具有抗真菌活性，并發現其具有一定的幾丁質酶活性。在以膠體幾丁質為底物的條件下，分析了該酶的最適反應溫度和最適反應pH以及金屬離子對該蛋白幾丁質酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

莜麥種子 產自山西應縣；蛋白分離純化的材料 DEAE－Sepharose Fast Flow柱、Superdex－200柱，均購自GE公司；甲殼素 購自中國生化制品廠；其它試劑 均為國產分析純；抗真菌活性測定所用的白腐菌（Trametes sp.SQ01）、毛殼菌（Chaetomium sp.R01）、紅曲霉（Monascuspurpureus） 為本實驗室保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 PRP蛋白的分離純化 將莜麥種子去殼粉碎，經丙酮脫脂后用含50mmol/L NaCl，50mmol/L Tris－HCl，pH8.0的緩沖液溶解，14000r/min 4℃離心30min，收集上清液，加入固體硫酸銨進行分級沉淀，收集30%～60%（NH4）2SO4沉淀。用50mmol/L Tris－HCl，pH8.0緩沖液懸浮，并用相同緩沖液在4℃進行透析。將透析后的樣品離心后上樣到經50mmol/L Tris－HCl，pH8.0緩沖液平衡的DEAE－Sepharose Fast Flow柱，進行鹽離子濃度梯度洗脫。收集活性峰，濃縮后上樣于50mmol/L Tris－HCl，150mmol/L NaCl pH8.0平衡的Superdex－200層析柱，收集活性部分，濃縮后進行SDS－PAGE電泳鑒定。

1.2.2 PRP分子量的測定 采用Superose12（10/30）預裝柱于AKTA purifier系統，用20mmol/L Tris－HCl，100mmol/L NaCl，pH8.0緩沖液預平衡凝膠柱，流速為0.5mL/min，室溫280nm紫外檢測。標準蛋白分子為牛血清白蛋白（136ku）、卵清蛋白（45ku）、胰蛋白酶（24ku）、溶菌酶（14.4ku）。根據Kav－lgMr作圖，求得該樣品的天然分子量。Kav=（Ve－V0）/（Vi－V0），其中Ve、Vi、V0分別是洗脫體積、柱體積和外排體積。亞基數目和亞基分子量采用SDS－PAGE分析。

1.2.3 PRP抗真菌活性分析 抗真菌活性的鑒定采用牛津杯法[11]。配制PDA培養基（成分：200g土豆，20g葡萄糖，2g磷酸二氫鉀，1g結晶硫酸鎂，10mgVB1），將菌株（白腐菌、毛殼菌、紅曲霉）點種于培養基的中心，于30℃條件下培養，當其菌落直徑長至1～2cm時向菌落的外圍加入滅菌的牛津杯，將該樣品和不含該樣品的其他條件完全相同的含50mmol/L NaCl的20mmol/L Tris－HCl，pH8.0緩沖液通過濾膜除菌加入牛津杯內，于4℃放置24h使其充分擴散，然后將平板放入30℃培養箱中進行培養過夜，進行觀察。

1.2.4 PRP幾丁質酶活性測定 采用3，5－二硝基水楊酸（DNS）法[12－13]。將100μL含10mg/mL的膠體幾丁質與相同體積的0.467mg/mL PRP蛋白在37℃下保溫30min后，加入1mL 3，5－二硝基水楊酸顯色劑，沸水浴10min終止反應，最后用蒸餾水定容至5mL，于540nm處測定光吸收值。以不加PRP作為對照。

幾丁質酶活力的定義為：在37℃條件下，每分鐘產生1μmol N－乙酰－D－氨基葡萄糖所需的酶量。

1.2.5 溫度對PRP幾丁質酶活性的影響 將電泳純的莜麥PRP蛋白，分別置于25、35、45、55、65、75℃條件下，在pH8.0的0.1mol/L Tris－HCl緩沖液中保溫30min，進行酶活性測定，確定最適反應溫度。將莜麥PRP蛋白在上述溫度下，先保溫30min，然后冰浴10min，在標準條件下進行酶活測定。

1.2.6 pH對PRP幾丁質酶的活性的影響 配制一系列100mmol/L的pH緩沖液：pH2～5為醋酸鹽緩沖液，pH6～8為磷酸鹽緩沖液，pH9～10為硼酸鹽緩沖液。將莜麥PRP蛋白在上述不同緩沖液于中37℃保溫30min，然后在標準條件下測定PRP幾丁質酶活性，確定PRP的幾丁質酶活性pH穩定性。最適pH的確定采用在上述不同pH條件下進行活性測定。

1.2.7 金屬離子對PRP蛋白活性的影響 先將莜麥PRP蛋白與各金屬離子在37℃保溫10min后，再加入10mg/mL幾丁質膠體底物，37℃反應30min，DNS法測定其酶活，以不含金屬離子的緩沖液為對照。

2 結果與分析

2.1 PRP蛋白的純化

莜麥種子經丙酮脫脂，獲得的粗蛋白溶液利用硫酸銨鹽析以及DEAE陰離子柱層析結合Superdex－200層析柱，我們首次從莜麥種子中分離到電泳純的PRP蛋白。采用SDS－PAGE分析蛋白的分子量大約在20ku左右，分子量接近病程相關蛋白的分子量范圍（圖1）。

圖1 12%SDS－PAGE檢測PRP蛋白的純化Fig.1 PurificationofPRPproteinsdeterminedby12%SDS－PAGE

2.2 蛋白分子分子量的測定

圖2 分子排阻層析對天然PRP蛋白分子量的測定Fig.2 Determination of nature PRP molecular weight by molecular exclusion chromatography

將獲得的電泳純PRP蛋白和標準蛋白質上樣于Superose12分子排阻層析，進行分子量的測定。PRP的洗脫體積為15.21mL，相應其Kav值為0.469，lgMr為4.37，根據Kav－lgMr作圖，可知其相對分子量為23.76ku（圖2），而SDS－PAGE結果顯示其分子量為22ku，進一步說明莜麥PRP蛋白是以單體形式存在的小分子量蛋白質（圖3）。該分子量也接近于TLP一類的PRP蛋白。

圖3 12%SDS－PAGE對PRP單體及亞基數的分析Fig.3 Analyze of PRP monomer and subunit by 12%SDS－PAGE

2.3 PRP抗真菌活性的鑒定

真菌主要是以菌絲方式進行擴散生長，若遇抑菌物質，菌落生長會產生類似彎月的菌落邊緣形態。從圖4中也可以定性地觀察到，PRP對白腐菌的抑菌效果最明顯，毛殼菌次之，對紅曲霉的抑制最不明顯，并且抑制活性存在劑量依賴性，其最小抑制濃度為30μg/mL。

圖4 PRP對真菌的抑制活性分析Fig.4 Inhibition activity of PRP to fungus

2.4 PRP幾丁質酶活性的最適溫度及pH

將PRP分別在25～75℃溫度范圍內，測定其幾丁質酶的活性，以及在上述溫度保溫30min后，置冰浴10min，在標準條件下測定不同保溫處理的PRP樣品，結果顯示PRP的幾丁質酶活性在55℃以下，酶活可以保留80%活力，具有良好的熱穩定性，當高于65℃，其酶活急劇下降；PRP的幾丁質酶活性的最適溫度為45℃（圖5）。比李奕雅[16]等報道的花生中的幾丁質酶溫度40～50℃范圍更大。

圖5 溫度對PRP幾丁質酶活的影響Fig.5 Effect of temperature on PRP fungus activity

將相同量的PRP蛋白，溶解在0.1mol/L的不同pH緩沖液中（pH2～5為醋酸鹽緩沖液，pH6～8為磷酸鹽緩沖液，pH9～10為硼酸鹽緩沖液），保溫30min，按1.2.4標準方法進行活性測定。結果表明，PRP在pH5.0時活力最高。而不同pH條件下保溫后，再在標準條件下進行活性測定，PRP在pH5.0～8.0可以穩定存在，并顯示幾丁質酶的活性（圖6）。該性質與李奕雅[14]等報道的花生中的幾丁質酶pH范圍相似。

圖6 pH對PRP幾丁質酶活的影響Fig.6 Effect of pH on PRP fungus activity

2.5 金屬離子對PRP幾丁質酶活性的影響

在PRP測活體系中添加終濃度為1mmol/L的不同金屬離子，保溫30min后，利用1.2.4標準方法進行幾丁質酶活性測定?？梢钥闯?，Mn2+有明顯的促進作用；Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Fe3+、Ca2+的促進作用不明顯；Co2+、Ni2+、Cu2+具有明顯的抑制作用（圖7）。而綠僵菌中金屬離子Zn2+、Ca2+、Ba2+和Mn2+離子對幾丁質酶活性有明顯的促進作用，而Hg2+、Co2+和Fe2+離子具有顯著抑制幾丁質酶活性的作用[15]。

圖7 金屬離子對PRP幾丁質酶活性的影響Fig.7 Effect of metal ions on PRP fungus activity

3 結論與討論

植物中普遍存在的抗病機制有兩種：過敏反應（hypersensitive response，HR）和系統獲得性抗性（systemic acquired resistance，SAR）[16]。自從煙草中的一些病程相關蛋白如幾丁質酶和β－1，3－葡聚糖酶被鑒定為具有潛在的抗真菌活性之后，病程相關蛋白參與植物系統獲得性抗性的結論被廣泛接受，但其作用機制尚不清楚。

莜麥的PRP至今未見任何國內外報道。利用硫酸銨沉淀、陰離子交換層析，從莜麥種子中分離提取到的一種病程相關蛋白，純化步驟簡單，樣品純度高。實驗發現其不僅有胰蛋白酶抑制活力，還具有抗真菌活性，進一步檢測到其具有一定的幾丁質酶活性。其活力和莜麥種子的真正意義上的幾丁質酶活力相比大約是其1/10的水平（結果未顯示），并且Mn2+能明顯地促進其酶活。其抗真菌的活性可能的機制是通過其發揮幾丁質酶的活性來顯示。但是病程相關蛋白的作用方式是否類似于動物體內的免疫蛋白，還有哪些重要因子同時參與，其信號轉導及基因表達的具體途徑怎樣，SAR和PRP的內在關系如何，這些均有待更多PRP結構的解析、基因表達調控的闡明及PRP作用模式的建立。

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Purification and characterization of pathogens-related proteins from Avena nuda

YAN Yong-fei，SHI Ya-wei*
（Institute of Biotechnology，Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

Pathogens-related proteins extensively existed in higher plants，which could be induced by various microorganism and belong to disease-resistant proteins that are attracted in the application fields.Through defatting with acetone，30%～60%（NH4）2SO4precipitation and DEAE ion exchange chromatography，Superdex-200 chromatography，pathogens-related proteins with the activity of chintinase was purified from the seeds of Avena nuda.The enzyme was stable from pH2.0～7.0 with optimum pH at 5.0.The optimum temperature of the enzyme was 45℃，and its activity was rapidly lost at temperatures above 65℃.The relative molecular weight was about 23.7ku.The growth of Trametes sp.SQ01 and Chaetomium sp.R01 were inhibited by the enzyme，with lowest dose of 30μg/mL.

pathogens-related proteins；Avena nuda；purification；characterization

TS210.1

A

1002－0306（2012）01－0094－04

2010－11－11 *通訊聯系人

閆永飛（1986－），女，碩士研究生，研究方向：蛋白質工程。

太原市明星專項資助。