枇杷花提取物抗氧化活性研究

閆永芳，孫 鈞，孟天真，葉興乾

（1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310029；2.浙江省農(nóng)業(yè)廳經(jīng)濟(jì)作物管理局，浙江杭州310020）

枇杷花提取物抗氧化活性研究

閆永芳1，孫 鈞2，孟天真1，葉興乾1

（1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310029；2.浙江省農(nóng)業(yè)廳經(jīng)濟(jì)作物管理局，浙江杭州310020）

采用DPPH、ABTS、FRAP和福林酚（F－C）四種方法測(cè)定枇杷花酚類化合物的抗氧化活性，比較最優(yōu)條件下蒸餾水、甲醇、乙醇三種溶劑的提取效率。結(jié)果表明，DPPH、ABTS、F－C法所測(cè)抗氧化活性順序一致，即為水提物＞甲醇提取物＞乙醇提取物，但當(dāng)量大小有所差異，其中F－C實(shí)驗(yàn)結(jié)果最大；FRAP實(shí)驗(yàn)中，甲醇提取物抗氧化活性略大于水提物，乙醇提取物活性最低。其原因可能是由于提取溶劑極性不同，反應(yīng)機(jī)理不同，F(xiàn)RAP法基于單電子轉(zhuǎn)移原理。因此，枇杷花酚類物質(zhì)在乙醇中的溶解性較差。

枇杷花，DPPH，ABTS，F(xiàn)－C，F(xiàn)RAP，抗氧化

枇杷花，為薔薇科枇杷屬植物枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）的花，既可作為飲品也可入藥，具有化痰止咳、和胃降氣的功效[1]。因枇杷花藥食功效顯著，近年來(lái)，有關(guān)枇杷花的深加工產(chǎn)品越來(lái)越受廣大消費(fèi)者歡迎，因此有必要對(duì)枇杷花功能性成分做深層次的研究。食品中的酚類化合物作為一種具有生物活性的功能性成分，備受關(guān)注。大量流行病學(xué)研究表明，酚類化合物具有淬滅單線態(tài)氧和清除自由基的作用[2]，與一些疾病的預(yù)防有密切關(guān)系，如各種癌癥、心血管和神經(jīng)性疾病以及衰老引起的相關(guān)疾病[3]。目前，受消費(fèi)者喜愛(ài)的一些飲品，如紅酒和可可飲料都富含酚類抗氧化物[4－5]。其次，酚類物質(zhì)還能賦予食品特殊的感官品質(zhì)，如紅酒，它可以賦予紅酒一些特有的感官特性，如色澤、澀味等[6]。酚類物質(zhì)還具有抗病毒、抗菌作用，顯著提高內(nèi)皮功能[7]，此外，酚類物質(zhì)是提高食品品質(zhì)、延長(zhǎng)保質(zhì)期的功能性物質(zhì)[8]。因此，評(píng)價(jià)消費(fèi)食品的抗氧化能力意義重大。本實(shí)驗(yàn)在以蒸餾水、甲醇和乙醇為最優(yōu)萃取條件前提下，采用DPPH、ABTS、福林酚（F－C）和FRAP四種方法比較枇杷花提取物的抗氧化活性，為進(jìn)一步研究枇杷花中酚類化合物組成提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

寧海白枇杷 2009年11月采集自浙江省寧波市寧海縣（東經(jīng)121°25′、北緯29°17′），采集的鮮枇杷花置于樣品袋中6h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室并進(jìn)行及時(shí)處理，將采集樣品過(guò)篩，收集花瓣，置于60℃干燥箱內(nèi)鼓風(fēng)干燥過(guò)夜，磨粉，儲(chǔ)存?zhèn)溆茫籉e3+－三吡啶三吖嗪（Tripyridyl－triazine，TPTZ）、ABTS[2，2’－Azinobis（3－ethylbenzothiazoline 6－sulphonate）]、6－羥基－2，5，7，8－四甲基色滿－2－羧酸（Trolox）、1，1－二苯基－2－苦基苯肼（1，1－Diphenyl－2－picryl－h(huán)ydrazyl，DPPH）、福林酚試劑（Folin－Ciocalteu reagent）、沒(méi)食子酸（Gallic acid） 均購(gòu)自Sigma公司；甲醇、乙醇、鹽酸等 均為分析級(jí)。

離心機(jī)KA－1000 上海安亭科學(xué)儀器廠；UV－2550紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本SHIMADZU公司。

1.2 枇杷花有效成分的提取

分別采用水、甲醇、乙醇熱回流浸提枇杷花中有效成分。料液比1∶15，回流提取2次，每次1.5h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，經(jīng)冷凍干燥分別得到三種溶劑抗氧化活性粗提物。分別配制一定濃度的樣品甲醇溶液備用。

1.3 抗氧化活性評(píng)價(jià)

1.3.1 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn) 測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[9]并略有改動(dòng)。配制0.1mmol/L的DPPH試劑，取0.1mL提取液與3.9mLDPPH試劑混合，在暗處反應(yīng)0.5h，隨后在515nm下測(cè)定吸光值。根據(jù)樣品吸光值的變化計(jì)算抑制率：

式中：A0為空白對(duì)照的吸光值，A1為樣品的吸光值。

以Trolox作為標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以Trolox當(dāng)量TE（Trolox equivalent）表示。

1.3.2 ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)[10]取440μL 140mmol/L的過(guò)硫酸鉀溶液加入到25mL 7mmol/L的ABTS溶液中混合，避光反應(yīng)12～16h。測(cè)定之前加入乙醇將ABTS溶液稀釋至吸光值為0.700±0.002（734nm下）。將3.9mL的ABTS溶液與0.1mL經(jīng)稀釋的提取液混合、搖勻，在室溫下反應(yīng)6min后，在734nm條件下測(cè)定其吸光值。抑制率計(jì)算方法及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作同1.3.1。

1.3.3 FRAP實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[11]方法并略作改動(dòng)。FRAP試劑的配制為0.1mol/L醋酸緩沖液（pH3.6）∶10mmol/L的TPTZ溶液（溶于40mmol/L鹽酸）∶20mmol/L三氯化鐵= 10∶1∶1。取3.9mL FRAP試劑與0.1mL的樣品混合反應(yīng)10min后，于593nm下測(cè)定吸光值。空白對(duì)照為0.1mL提取溶劑。以Trolox作為標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果用Trolox當(dāng)量TE（Trolox equivalent）表示。

1.3.4 福林酚法（F－C） 參考文獻(xiàn)[12]并略有改動(dòng)。取枇杷花提取液0.25mL，加入到25mL具塞試管中，同時(shí)加入0.25mL F－C試劑，在暗室中反應(yīng)3min。加入2mL濃度為5%的碳酸鈉溶液，加蒸餾水至15mL，在暗室中反應(yīng)25min。并在750nm下測(cè)定吸光值。以沒(méi)食子酸作為標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，抗氧化活性用沒(méi)食子酸當(dāng)量GAE（Gallic acid equivalent）表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果以平均值±SD標(biāo)示。數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行方差分析，顯著水平P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 清除DPPH·的能力

DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)是常用的體外抗氧化活性評(píng)價(jià)方法之一。該方法對(duì)反應(yīng)物有一定的選擇性，且達(dá)到穩(wěn)定所需時(shí)間長(zhǎng)。枇杷花的不同溶劑提取物對(duì)DPPH·的清除能力結(jié)果如表1所示。清除DPPH自由基能力的次序?yàn)閂C＞水提物＞BHA＞VE＞甲醇提取物＞乙醇提取物，其中VC效果最好（0.065mg/mL）；水提物在該實(shí)驗(yàn)中也表現(xiàn)出良好的效果，IC50值為0.105mg/mL，低于陽(yáng)性對(duì)照BHA（0.126mg/mL）和VE（0.135mg/mL）；甲醇和乙醇提取效果較差，IC50值分別為0.165mg/mL和0.203mg/mL。

表1 枇杷花不同溶劑提取物清除DPPH·、ABTS+·能力比較Table 1 Comparison of scavenging DPPH·，ABTS+·capacities of extracts with different solvents

2.2 清除ABTS+·的能力

ABTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，ABTS實(shí)驗(yàn)中各枇杷花提取物的抗氧化活性的強(qiáng)弱順序與DPPH實(shí)驗(yàn)組結(jié)果類似，即VC＞水提物＞BHA＞VE＞甲醇提取物＞乙醇提取物，但I(xiàn)C50值略低。VC的抗氧化活性最強(qiáng)（0.074mg/mL），水提物IC50值為0.081mg/mL，低于陽(yáng)性對(duì)照BHA（0.102mg/mL）和VE（0.140mg/mL）；甲醇提取物活性稍強(qiáng)于乙醇提取物，其IC50值分別達(dá)到0.146mg/mL和0.157mg/mL。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，DPPH法與ABTS法所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果的總體趨勢(shì)非常相似。

2.3 FRAP實(shí)驗(yàn)測(cè)定抗氧化能力

FRAP實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，F(xiàn)RAP測(cè)試體系中，不同溶劑提取物的抗氧化活性次序?yàn)榧状继崛∥铮?9.61mgTE/g）＞水提物（48.76mgTE/g）＞乙醇提取物（23.99mgTE/g）。與其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比，F(xiàn)RAP甲醇提取物活性高于水提物，這與DPPH、ABTS和F－C的實(shí)驗(yàn)結(jié)果略有不同。這可能是由于反應(yīng)機(jī)理不同所致：FRAP法基于單電子轉(zhuǎn)移機(jī)理，而ABTS、DPPH、F－C則由單電子轉(zhuǎn)移和氫原子轉(zhuǎn)移共同發(fā)生作用[12]。由此進(jìn)一步驗(yàn)證，不同方法其抗氧化活性測(cè)定結(jié)果有很大差異，不能僅用單一方法評(píng)價(jià)抗氧化活性[13－14]。

2.4 F-C法測(cè)定抗氧化活性

F－C法是一種使用非常廣泛的總酚測(cè)定方法。參考文獻(xiàn)[12]，在此基礎(chǔ)之上經(jīng)過(guò)略微改動(dòng)，與其他方法結(jié)合測(cè)定枇杷花提取物的抗氧化活性。酚類物質(zhì)可以參與到氧化還原反應(yīng)中，與抗氧化能力有很大的相關(guān)性。由表2可以看出，F(xiàn)－C實(shí)驗(yàn)中水提物約為甲醇提取物活性的2.4倍（GAE分別為137.90mgGAE/g和56.76mgGAE/g），是乙醇提取物活性的4.1倍（GAE為33.47mgGAE/g），其整個(gè)趨勢(shì)與DPPH、ABTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果非常相似。值得注意的是沒(méi)食子酸當(dāng)量在33mgGAE/g和140mgGAE/g之間，測(cè)定結(jié)果高于其他實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果。原因可能是該方法并不僅限于酚類物質(zhì)，很多非酚類物質(zhì)，如抗壞血酸以及一些糖類化合物，同樣可以與F－C試劑反應(yīng)[15]；其次，有報(bào)道沒(méi)食子酸作標(biāo)準(zhǔn)時(shí)其反應(yīng)活性和吸收值較Trolox高[16]，這也可能致使F－C法實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏高。

3 結(jié)論

DPPH、ABTS和F－C實(shí)驗(yàn)中，枇杷花的水、甲醇和乙醇三種溶劑提取物的抗氧化活性強(qiáng)弱順序基本一致，水提物＞甲醇提取物＞乙醇提取物，其中F－C實(shí)驗(yàn)結(jié)果當(dāng)量數(shù)值最大；FRAP實(shí)驗(yàn)敏感性較差，TE值較低，且三種溶劑提取物的抗氧化活性強(qiáng)弱順序略有不同。通過(guò)四種抗氧化活性評(píng)價(jià)方法比較得出，枇杷花水提物和甲醇提取物的抗氧化活性要高于乙醇提取物。因此，可以推斷枇杷花中的酚類化合物在乙醇中溶解得較少。本實(shí)驗(yàn)為枇杷花中酚類物質(zhì)的進(jìn)一步研究提供了理論依據(jù)。

[1]全國(guó)中草藥匯編編寫組.全國(guó)中草藥匯編[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1996：504.

[2]Lamoral－TheysD，PottierL，DufrasneF，etal.Naturalpolyphenols that display anticancer properties through inhibition of kinase activity[J].Current Medicinal Chemistry，2010，17（9）：812－825.

[3]Guo Q，Zhao B，Shen S，et al.ESR study on the structureantioxidant activity relationship of tea flavan－3－ols and their epimers[J].Biochimica et Biophysica Acta，1999，1427：13－23.

[4]Lee K W，Kim Y J，Lee H J，et al.Cocoa has more phenolic phytochemicals and a higher antioxidant capacity than teas and red wine[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003，51：7292－7295.

[5]Fernandez－Pachon，M S，Villano D，et al.Determination of the phenolic composition of sherry and table white wines by liquid chromatography and their relation with antioxidant activity [J].Analytica Chemica Acta，2006，563：101－108.

[6]Paixao N，Perestrelo R，Marques J C，et al.Relationship between antioxidant capacity and total phenolic content of red，rose and white wines[J].Food Chemistry，2007，105（1）：204－214.

[7]Li H，Zhou C，Pan Y，et al.Evaluation of antiviral activity of compounds isolated from Ranunculus sieboldii and Ranunculus sceleratus[J].Planta Medica，2005，71（12）：1128－1133.

[8]Becker E M，Nissen L R，Skibsted L H.Antioxidant evaluation protocols：Food quality or health effects[J].European Food Research and Technology，2004，219（6）：561－571.

[9]Gorinstein S，Haruenkit R，Park Y S，et al.Bioactive compounds and antioxidant potential in fresh and dried JaffaR sweeties，a new kind of citrus fruit[J].Journal of the Science of Food and Agriculture，2004，84：1459－1463.

[10]Re R，Pellegrini N，Proteggente A，et al.Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation recolorization assay [J].Free Radical Biology Medicine，1999，26：1231－1237.

[11]Benzie I E F，Strain J J.The ferric reducing ability of plasma（FRAP）as a measure of antioxidant power：The FRAP assay[J]. Analytical Biochemistry，1996，239：70－76.

[12]Prior R L，Wu X，Schaich K.Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietarysupplements[J].JournalofAgricultural and Food Chemistry，2005，53（10）：4290－4302.

[13]Frankel E，Meyer A S.The problems of using one－dimensional methodstoevaluatemultifunctionalfoodandbiologicalantioxidants [J].Journal of the Science of Food and Agriculture，2000，80：1925－1941.

[14]Huang D，Ou B，Prior R L.The chemistry behind antioxidant capacity assays[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，53：1841－1856.

[15]Stratil P，Klejdus B，Kuban V.Determination of phenolic compounds and their antioxidant activity in fruits and cereals[J]. Talanta，2007，71：1741－1751.

[16]Stratil P，Klejdus B，Kubáň V.Determination of total content ofphenolic compounds and theirantioxidantactivity in vegetables evaluation of spectrophotometric methods[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54（3）：607－616.

Antioxidant capacities of loquat flower extracts using different solvents

YAN Yong-fang1，SUN Jun2，MENG Tian-zhen1，YE Xing-qian1
（1.College of Biosystem Engineering and Food Science，Zhejiang University，Hangzhou 310029，China；2.Industrial Crop Bureau，Agriculture Department of Zhejiang Province，Hangzhou 310020，China）

DPPH，ABTS，F(xiàn)RAP and F-C methods were used to analyze the antioxidant capacity of loquat flowers extracts.The results showed that water extracts exhibited the highest antioxidant capacity，followed by methanol extracts and ethanol extracts in the three methods（DPPH，ABTS，F(xiàn)-C）.In the FRAP method the methanol extracts showed higher antioxidant capacity than the water extracts.That may be due to different extract solvents and different reaction mechanisms.In general，the ethanol extracts exhibited the lowest antioxidant capacity.

loquat flower；DPPH；ABTS；F-C；FRAP；antioxidant capacity

TS255.1

A

1002－0306（2012）01－0122－03

2010－12－20

閆永芳（1987－），女，碩士研究生，研究方向：食品工藝、食品安全及控制技術(shù)。

教育部創(chuàng)新工程重大項(xiàng)目培育資金項(xiàng)目（707034）；浙江省重大科技專項(xiàng)重點(diǎn)項(xiàng)目（2008C02005－2）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助。