MCM-41固定化柚苷酶脫苦葡萄柚汁

雷生姣，潘思軼，肖 敏，馬少君，呂曉燕

（華中農業大學食品科學與技術學院，湖北武漢430070）

MCM-41固定化柚苷酶脫苦葡萄柚汁

雷生姣，潘思軼*，肖 敏，馬少君，呂曉燕

（華中農業大學食品科學與技術學院，湖北武漢430070）

以介孔分子篩MCM-41為載體，戊二醛為交聯劑，采用吸附-交聯法進行了柚苷酶的固定化。研究了酶液濃度、戊二醛濃度、吸附交聯時間和固定化pH對固定化效果的影響，對影響固定化效果的因素進行了分析。確定最佳的固定化條件為：酶液濃度為0.4mg/mL，戊二醛濃度2.0%，吸附交聯時間為6h，固定化pH為4.0（醋酸緩沖液）。采用海藻酸鈉和聚乙烯醇對制備的固定化酶進行二次包埋處理，并應用于葡萄柚汁的脫苦。結果顯示，游離酶和MCM-41固定化酶對果汁的脫苦率分別為96.65%和92.90%，海藻酸鈉和聚乙烯醇二次固定化的柚苷酶脫苦率分別為72.64%和70.90%。脫苦后的果汁營養成分與理化指標均有一定程度降低。為柚苷酶的固定化提供了一種新型的載體材料，為固定化柚苷酶在果汁脫苦中的工業化應用提供了理論基礎。

柚苷酶，MCM-41，固定化，脫苦，葡萄柚

柚皮苷（Naringin）是柑橘類果汁中主要的苦味物質之一，是一種二氫黃酮類化合物，是黃酮類化合物的主要代表物之一，主要存在于蕓香科植物（Pummelo，Citrus grandis）、葡萄柚（Grapefruit）、酸橙（Sour orange）及其變種的果皮和果實中[1]，其化學名為柚皮素-7-β-D-葡萄糖（2→l）-α-L-鼠李糖。柚苷酶（EC3.2.1.40）主要來源于曲霉屬和青霉屬，具有α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶的活性，在pH4.0時具有較高的活性[2]。它其中的α-L-鼠李糖苷酶能將柚皮苷水解為鼠李糖和普魯寧（苦味約為柚皮苷的1/3）；普魯寧在β-D-葡萄糖苷酶的作用下又能被水解成柚皮素（無苦味）和葡萄糖。葡萄柚屬柑橘屬（Citrus），又稱為西柚，是廣受歡迎的一類水果。葡萄柚汁經存放或加熱處理后會產生令人難以接受的苦味，影響產品的品質和價值，因此葡萄柚汁必須進行脫苦處理。脫除果汁苦味物質的方法主要有利用吸附劑脫苦[3-4]、膜過濾[5]、離子交換樹脂脫苦[6-7]和其他脫苦方法等[8-9]。生物酶法中研究較多的是固定化柚苷酶，它具有專一性強、效果好、成本低等優點；而且柚皮素具有許多類似于柚皮苷的生物活性[10]，對人類健康有益。影響固定化效果的因素很多，而固定化載體是其中最重要的影響因素之一。介孔分子篩作為一種新型的無機載體材料，正日益成為生物酶固定化的宿主材料[11]。它具有納米級規則孔道、高的比表面積和易于表面功能化等優點，表面帶有弱酸性硅羥基（-SiOH），能與酶分子的氨基通過氫鍵、范德華力、靜電力等弱相互作用而將其固定于分子篩表面。MCM-41介孔分子篩是研究較多的固定化載體，它具有六方有序規則排列的一維孔道，比表面積可達1000m2/g，孔容平均為0.7～1.2cm3/g。目前已有報道將細胞色素[12]、木瓜蛋白酶[13]、胰蛋白酶[14]、維生素[15]、肌紅蛋白[16]和脂肪酶[17]等固定在其上，但未見柚苷酶固定在其上的報道。本文以介孔分子篩MCM-41為載體，戊二醛為交聯劑，制備了性質穩定的粉末狀固定化柚苷酶。制備的固定化酶應用于葡萄柚汁脫苦時，由于其為粉末狀，操作繁瑣，因而結合海藻酸鈉和聚乙烯醇易于成型、具有良好的生物相容性、來源廣泛以及無毒副作用等優點，通過二次固定化制備了固定化酶凝珠。同時，比較了三種不同方法制備的固定化酶對葡萄柚汁的脫苦效果，為固定化柚苷酶的工業化應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄柚 湖北松滋望春花食品有限公司；柚苷酶（CAS號：9068-31-9） Sigma-Aldrich公司，活力369U/g；柚皮苷 Sigma-Aldrich公司，HLPC 98%；檸檬苦素、柚皮素 成都普思生物科技有限公司，HLPC 98%；介孔分子篩MCM-41 上海卓悅化工科技有限公司；海藻酸鈉（SA） 上海化學試劑分裝廠，化學純；聚乙烯醇（PVA），（1750±50）u、一縮二乙二醇（DEG）、25%戊二醛 國藥集團化學試劑有限公司，分析純；乙腈美國TEDIA公司，色譜純。

高效液相色譜儀 配有可變波長紫外檢測器和Millennium 32色譜工作站，美國WATERS公司；分析天平AR5120 梅特勒-托利多儀器有限公司；低溫高速離心機 Avanti J-E型，美國Beckman Coulter公司；雙功能水浴恒溫振蕩器 金壇市杰瑞爾電器有限公司；pH計 SARTORIUS AG公司；折光儀 上海測維光電技術有限公司；HHS-6型恒溫水浴鍋 國華電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葡萄柚汁的制備 葡萄柚人工去皮后，用榨汁機進行榨汁，榨取的葡萄柚汁-14℃冷藏。將冷藏過的葡萄柚汁在室溫下自然解凍，在4200r/min下離心15min，得葡萄柚原果汁。

1.2.2 固定化柚苷酶的制備

1.2.2.1 介孔分子篩MCM-41固定化柚苷酶 10mL的離心管中稱取0.01g介孔分子篩MCM-41，加入1.0mL用0.2mol/L的醋酸緩沖液（pH4.0）配制的0.4mg/mL的柚苷酶溶液和0.08mL 25%的戊二醛（占總體積2%），置于15℃的恒溫振蕩器（150r/min）中吸附6h，低溫離心機（4200r/min）中離心15min，棄去上清液，再用2.0mL的0.2mol/L的醋酸緩沖液（pH4.0）洗滌、離心，連續進行三次，即制得MCM-41固定化柚苷酶濕樣，儲藏于4℃冰箱中備用。

1.2.2.2 海藻酸鈉（SA）-MCM41固定化柚苷酶 按

1.2.2.1 的方法制備0.5g MCM-41固定化酶，與100g 3%的海藻酸鈉溶液充分混勻，用5mL注射器勻速滴入4%CaCl2溶液中，固化1h，蒸餾水潤洗3次，即可制得3～5mm的固定化柚苷酶凝珠，吸水紙吸干后冰箱中儲藏備用。

1.2.2.3 聚乙烯醇（PVA）-MCM41固定化柚苷酶 按1.2.2.1的方法制備0.5g MCM-41固定化酶，與100g 9%的聚乙烯醇和1%的海藻酸鈉混合溶液充分混勻，用5mL注射器勻速滴入4%硼酸和1%CaCl2溶液中固化2h，蒸餾水潤洗3次，即可制得3～5mm的固定化柚苷酶凝珠，吸水紙吸干后冰箱中儲藏備用。

1.2.3 固定化柚苷酶脫苦葡萄柚汁 含2.0mg柚苷酶的MCM-41、SA-MCM41和PVA-MCM41固定化酶分別加入20mL葡萄柚汁中，充分密封混合，置于60℃恒溫水浴鍋中反應30min，再立即于100℃沸水浴中滅酶活5min，酶解后的果汁自然冷卻后用于測定苦味物質的含量和理化指標。

1.3 測定方法

1.3.1 柚苷酶活力的測定 固定化酶活力測定：改進的Davis’[18]法測定反應液中柚皮苷的含量；1.0mL反應體系中（0.2mol/L醋酸緩沖液，pH4.0）含0.1mg柚苷酶和0.6mL底物柚皮苷（500μg/mL），60℃的恒溫振蕩器（150r/min）中精確反應30min后，添加4.9mL 90% DEG和4.0mol/L NaOH 0.1mL，充分搖勻，在40℃水浴鍋中保溫發色10min；取出注入1cm比色皿內，用紫外分光光度計在420nm處測定吸光值，通過柚皮苷標準曲線計算酶活力。

以0～250μg/mL柚皮苷為標準溶液，添加90% DEG于40℃顯色10min，420nm測定吸光值，以柚皮苷濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標制作標準曲線。得柚皮苷標準曲線方程為：y=0.0035x-0.0002。

相對活力（%）＝固定化酶的活力/固定化酶的最高活力×100%

1.3.2 高效液相色譜法（HPLC）測定葡萄柚汁中的苦味物質 葡萄柚汁中柚皮苷、柚皮素和檸檬苦素的測定采用HPLC法[19]。HPLC檢測中流動相為A（乙腈）和B（水），流速1.0mL/min，檢測波長280nm。C18色譜柱（4.3mm×25cm），進樣量20μL，柱溫25℃。流動相按下述條件進行：0～8min，23%A；8～15min，23%～65% A linear；15～20min，65%～70%A linear；20～21min，70%～ 23%A linear；21～22min，23%A。柚皮苷、柚皮素和檸檬苦素的定量采用HPLC峰面積與物質的濃度之間的關系進行計算。

1.3.3 葡萄柚汁理化指標的測定 葡萄柚汁中可溶性固形物采用手持折光儀測定（國標ISO 2173-78），pH用pH計進行測定，可溶性糖含量采用蒽酮法進行測定[20]，根據GB/T 6195-1986測定維生素C的含量和GB/T12456-1990測定總酸含量。

2 結果與分析

2.1 介孔分子篩MCM-41固定化柚苷酶工藝條件優化

2.1.1 MCM-41介孔分子篩的承載量 按1.2.2.1的方法，其他固定化條件不變，分別加入不同濃度（0.2～0.7mg/mL）的柚苷酶進行固定化吸附，假設吸附完全進行，則每克載體上承載的酶為20～70mg。按1.3.1固定化酶活力測定方法測定相對活力，實驗結果如圖1所示。

圖1 MCM-41介孔分子篩的承載量Fig.1 Naringinase loading on MCM-41 materials

由圖1可知，當載體的承載量從20mg/g載體增加到40mg/g載體時，固定化酶的相對活性迅速增加；當承載量從40mg/g載體繼續增加到70mg/g載體時，固定化酶的相對活性開始隨著承載量的增加而下降。這種變化規律主要與MCM-41孔道的容量有關。當介孔分子篩的孔道被酶分子所飽和時，固定化酶活性達到最大；此后繼續增加酶量，過多的酶分子負載于分子篩孔道中會導致孔道堵塞，使孔道內的酶分子的活性無法表現出來，固定化酶的相對活性下降。因此，本實驗選擇0.4mg/mL的酶液進行固定化，即MCM-41的承載量為40mg/g載體。

2.1.2 戊二醛濃度對固定化效果的影響 按1.2.2.1的方法，其他固定化條件不變，分別加入不同體積（0.02～0.12mL）的25%的戊二醛，即戊二醛的體積比為0.5%～3.0%（占總體積），按1.3.1固定化酶活力測定方法測定相對活力，則體系中戊二醛濃度對固定化效果的影響如圖2所示。

圖2 戊二醛濃度對固定化酶相對活力的影響Fig.2 Effect of the glutaraldehyde concentration on the relative activity of the immobilized naringinase

由圖2可知，固定化過程中戊二醛濃度從0.5%添加至2.0%時，載體上固定的酶量迅速增加，表現為固定化酶的相對活力增加；當戊二醛濃度繼續增加至3.0%時，固定化酶的相對活性開始緩慢下降。在酶的固定化反應中，戊二醛作為交聯劑，能提供有效的醛基，使酶分子與載體更易發生交聯，提高固定化效率；但是同時，戊二醛也是酶的變性劑，過量的戊二醛會引起酶的失活。綜上所述，當戊二醛濃度低于2.0%時，其綜合作用對酶固定化有利；當戊二醛濃度高于2.0%時，其綜合作用不利于酶的固定化。因此，本實驗中確定戊二醛濃度為2.0%。

2.1.3 pH對固定化效果的影響 按1.2.2.1的方法，其他固定化條件不變，改變緩沖體系的pH，按1.3.1固定化酶活力測定方法測定相對活力，則介孔分子篩MCM-41固定化柚苷酶的適宜pH如圖3所示。

圖3 pH對固定化酶相對活力的影響Fig.3 Effect of pH on the relative activity of the immobilized naringinase

由圖3可知，固定化反應過程中pH從2.5提高至4.0時，固定化酶的相對活力迅速由63.41%提高至最大值；當pH超過4.0時，固定化酶的相對活力則呈下降趨勢。在介孔分子篩固定化酶的過程中，酶分子主要是通過與載體表面的羥基形成氫鍵的方式吸附在載體表面上，因而材料表面的帶電性質和酶分子的帶電性質就決定了兩者之間作用力的大小，而pH影響了兩者的帶電情況。根據Takahashi[21]的研究，介孔分子篩MCM-41表面硅羥基具有較強的陰離子電勢，傾向于吸附陽離子，即材料表面有利于吸附帶正電荷殘基的酶，即在酸性范圍固定化效果較好。柚苷酶固定在MCM-41上，pH4.0時相對活力最大，說明此條件下兩者作用力最強。此外，酶分子通過戊二醛與載體之間的交聯在pH4.0時也可能最穩定。因此，本實驗確定MCM-41固定化柚苷酶體系的pH為4.0。

2.1.4 酶吸附-交聯時間對固定化效果的影響 按

1.2.2.1 的方法，其他固定化條件不變，改變固定化酶的吸附時間后制備固定化酶，按1.3.1固定化酶活力測定方法測定相對活力，結果如圖4所示。

圖4 吸附-交聯時間對固定化酶相對活力的影響Fig.4 Effect of absorb-crosslinking time on the relative activity of the immobilized naringinase

介孔分子篩表面及內部為多孔有序結構，分子在載體內部的擴散反應需要一定時間。由圖4可知，固定化反應時間在1～6h內，隨著固定化時間的延長，酶的相對活力也隨之增加；固定化反應達到6h時，固定在載體上的酶量達到最大值，相對活力最高；但超過6h后，隨著時間的延長，酶的相對活力迅速下降。這是因為如果固定化時間太長，更多酶分子的進入引起孔道堵塞，使孔道內的酶分子不能表現其活性。此外時間越長，戊二醛導致的失活酶分子也越多，這也是引起固定化酶相對活性下降的原因之一。因此，本實驗固定化酶的最佳吸附交聯時間為6h。

在優化條件下制備的MCM41固定化酶的活力回收率可達90%左右。

2.2 紫外檢測波長的選擇與確定

取適當濃度的柚皮苷、柚皮素和檸檬苦素標準品，在HPLC測定中，于200～400nm處進行紫外掃描，結合流動相對分析的影響，確定最適波長，結果如圖5所示。

結果表明，柚皮苷在282.9nm有最大吸收值，柚皮素在288.8nm有最大吸收，檸檬苦素在223.7nm有最大吸收值。綜合考慮，確定物質的吸收波長為283nm。

圖5 柚皮苷、柚皮素和檸檬苦素標準品的紫外掃描圖譜Fig.5 UV profiles of standard naringin,naringenin and liminon

2.3 苦味物的標準曲線的制定

圖6為柚皮苷、柚皮素和檸檬苦素標準品和葡萄柚汁的HPLC圖譜。由圖6a可知，柚皮苷、柚皮素和檸檬苦素標準品的出峰時間分別為8.029、16.018、18.038min。由圖6b和c可以看出，葡萄柚汁酶解前后的物質出峰時間穩定，與標準品基本一致，說明HPLC中采用的流動相能應用于以上三種物質的含量測定。

以HPLC測定結果中標準品的峰面積為縱坐標，各物質的濃度為橫坐標作圖，得到相應標準品的曲線方程分別為：y柚皮苷=15551x-7533，y柚皮素= 31452x+10612，y檸檬苦素=2504x-1302；其相對應的相關系數分別為0.9998、0.9933和0.9993。

2.4 固定化柚苷酶對葡萄柚汁的脫苦

表1為葡萄柚汁酶解前后柚皮苷、柚皮素和檸檬苦素的含量比較，其中脫苦率為酶解后果汁中的柚皮苷與原果汁中的柚皮苷含量之比，用百分數表示。由表可知，游離柚苷酶和MCM-41固定化柚苷酶對果汁的脫苦效果較好，產生的柚皮素較多；SA-MCM41柚苷酶和PVA-MCM41柚苷酶對果汁的脫苦效果相對較低，產生的柚皮素也較少；而且它們對果汁中的檸檬苦素影響均較小。這主要是因為SA和PVA凝珠均為網絡大孔狀結構，底物在其的擴散與反應均需要一定的時間，同時網絡結構對底物與產物還存在一定的束縛作用，影響了酶解反應的進一步進行，因此與游離酶和粉末狀的MCM-41固定化酶相比，脫苦效果會降低，產生的柚皮素也相應減少。

以SA和PVA對MCM41-naringinase進行二次固定化后，盡管對葡萄柚汁的脫苦效果有所降低，但由于二次固定化后，柚苷酶能被重復應用于果汁脫苦，且凝珠易于與產品進行分離，操作簡便，節約了工業化應用中的成本，因而具有較強的實用價值。

圖6 HPLC圖譜：柚皮苷、柚皮素和檸檬苦素標準品（a），原葡萄柚汁（b），MCM-41固定化酶酶解的葡萄柚汁（c）Fig.6 HPLC profiles of standard naringin,naringinin and liminon（a），and raw grapefruit juice（b）and after hydrolyzed by MCM-41 naringinase（c）

表1 葡萄柚汁酶解前后苦味物的比較Table 1 The bitter compound of grapefruit juice before and after debittering

2.5 葡萄柚汁脫苦前與脫苦后的理化指標比較

采用酶法脫除葡萄柚汁中的苦味物質柚皮苷，使得果汁風味更佳，更適合普通消費者的飲用習慣，然而脫苦后果汁中的營養成分會有一些損失，因此有必要在脫苦后檢測果汁中營養成分的變化。葡萄柚汁經柚苷酶脫苦前后的營養成分與理化指標的測定結果見表2。由于果汁脫苦后，于100℃沸水中處理過，因此營養成分維生素C在酶解液中含量很少，可在后續加工過程中進行補充；其它指標，如可溶性固形物、pH、總酸以及總糖含量均有下降。

表2 葡萄柚汁酶解前后理化指標的比較Table 2 The characteristics of grapefruit juice before and after debittering

3 結論

與其它酶固定化載體相比，介孔材料是一種新型的環境友好型多孔材料，其大的比表面積和分布均勻的孔道結構可使其用于酶的固定化。海藻酸鈉和聚乙烯醇是應用最為廣泛的固定化酶載體。介孔分子篩有序的空間孔道結構為酶的固定化提供了一個天然的微環境，減少了酶的變性；同時，二次固定化又有效地防止了酶在介孔材料表面的泄露，提高了固定化酶的應用前景。研究結果表明，柚苷酶可通過吸附-交聯法固定于介孔分子篩MCM-41孔道中，在適宜的固定化條件下，載體的承載量可達40mg/g載體，優于其它類的載體，而且制備的固定化酶性質穩定，酶活力回收率高。因此，以介孔分子篩MCM-41作為載體，為柚苷酶的固定化提供了一種新型的載體材料，有利于解決柚苷酶實際應用中的限制問題。

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Naringinase immobilized on MCM-41 to debitter grapefruit juice

LEI Sheng-jiao，PAN Si-yi*，XIAO Min，MA Shao-jun，LV Xiao-yan
（College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China）

The mesoporous molecular sieve MCM-41 was employed as a support to immobilize naringinase. And adsorption method and crosslinked with the bifunctional agent glutaraldehyde（GA）were adopted to improve enzyme loading.The effects of naringinase and GA concentration，immobilization time and pH on the activity of immobilized naringianse were investigated.The main factors which influenced the immobilization process and properties of the immobilized enzyme also were analyzed and discussed.The optimum conditions for immobilization of naringinase were as follows：naringianse and GA concentration were 0.4mg/mL and 2.0% respectively，and the immobilization time of 6h in pH 4.0（acetate buffer）.Sodium alginate（SA）and polyvinyl alcohol（PVA）were used to embed the immobilized MCM41-naringinase secondly and apply to debitter grapefruit juice.The results showed that debittering rate of the free and immobilized MCM41-narnginase were 96.65%and 92.90%，and embedded naringinase secondly with SA and PVA were 72.64%and 70.90%，respectively.The nutrition and physical characteristics of the grapefruit juice after debittered were decreased to some extent.A new matrix material to immobilize naringinase and provided the theoretical basis for its industrial applications in debitter juice.

naringinase；MCM-41；immobilization；debittering；grape fruit

TS255.1

A

1002-0306（2012）01-0189-05

2010－11－03 *通訊聯系人

雷生姣（1975-），女，博士研究生，研究方向：糧食、油脂與植物蛋白工程。