一次過柱法快速分離純化驢心肌中高鐵肌紅蛋白

李沛軍，孔保華，鄭冬梅，陳 倩

（東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030）

一次過柱法快速分離純化驢心肌中高鐵肌紅蛋白

李沛軍，孔保華*，鄭冬梅，陳 倩

（東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030）

肌紅蛋白及其存在形式是決定肉和肉制品色澤的重要因素，高鐵肌紅蛋白為其重要存在形式之一。以馬科動物－驢的心肌為原料，采用70%～100%飽和硫酸銨分段鹽析法粗提肌紅蛋白，加入鐵氰化鉀氧化后透析，經CMSephadex Fast Flow陽離子交換柱層析進行一步純化。SDS－PAGE電泳和紫外/可見光光譜掃描結果表明，僅通過一次柱交換，即可得到電泳純的高鐵肌紅蛋白，為快速提取、純化高鐵肌紅蛋白提供了一條途徑。

驢心肌，高鐵肌紅蛋白，純化，電泳純

肉的色澤是影響消費者購買肉制品的重要因素[1－2]。肉的顏色主要取決于肌肉中的兩種色素蛋白質，即血紅蛋白和肌紅蛋白的含量，以及血色素存在的形式。肌紅蛋白為肉自身的色素蛋白，肉色的深淺與其含量多少有關；血紅蛋白存在于血液中，對肉顏色的影響要視放血情況而定。放血良好的肉，肌肉中肌紅蛋白色素占80%～90%，比血紅蛋白豐富的多[3]，是決定肉顏色的主要因素。肌紅蛋白是一種球狀的血紅素蛋白，分子量約為17000[4]，在動物的需氧器官和心室中含量豐富。在通常條件下，肌紅蛋白（Myoglobin，Mb）有三種存在形式：還原型肌紅蛋白（DMb）、氧合肌紅蛋白（MbO2）、高鐵肌紅蛋白（Met－Mb）[5]。純品肌紅蛋白主要用于肌肉基礎[6]和醫學領域研究[7－8]。目前我國的純品肌紅蛋白主要依靠進口，價格昂貴，國內企業尚無肌紅蛋白商品生產。在肉品科學研究中，很多研究都需要應用到純品肌紅蛋白，用于研究肉制品的顏色變化[9]，以及相關酶的作用[10]。關于對肌紅蛋白的分離純化有一些報道。湯祥明、Chaijan和Enoki分別采用兩次柱層析法，對豬心肌[11]、鳥骨骼肌[12]和沙丁魚肌肉[13]中肌紅蛋白的提取純化進行了研究，方法繁瑣，提取效率不高；Joseph從野牛心肌中提取、純化了肌紅蛋白[14]，方法耗時多，需要較高的成本[11]。很多報道中用到的肌紅蛋白均為馬心肌紅蛋白的氧化態－高鐵肌紅蛋白[15－19]，高鐵肌紅蛋白較還原型肌紅蛋白更為穩定，提取時不需要苛刻的外界條件；而驢（Equus asinus）屬馬科、馬屬[20]，且原料較馬心易得。因此，選用肌紅蛋白含量高的驢心肌作為原料，進行提取、純化高鐵肌紅蛋白的研究。本文采用硫酸銨分段鹽析法粗提驢心肌中的高鐵肌紅蛋白，然后通過一次陽離子交換柱層析進行純化，以期在較短的時間內得到電泳純的高鐵肌紅蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮驢心 購自哈爾濱橫道街市場，4℃冷藏運輸；羧甲基纖維素瓊脂糖凝膠（CM－Sepharose Fast Flow） 美國GE healthcare公司；聚乙二醇（PEG）－20000 德國merck公司；牛血清白蛋白（BSA） 美國Sigma Aldrich公司；考馬斯亮藍試劑盒 南京建成生物工程研究所；肌紅蛋白萃取緩沖液 1mmol/L乙二胺四乙酸二鈉（EDTA），0.05mol/L Na2HPO4－NaH2PO4，pH6.0；層析緩沖液A 1mmol/L EDTA，0.02mol/L Na2HPO4－NaH2PO4，pH6.0；層析液B 0.5mol/L NaCl；其它化學試劑 均為分析純。

Bio Logic LP低壓層析系統，垂直電泳設備Mini－PROTEAN Tetra Cell，0.45μm濾膜 美國BIO－RAD公司；透析袋（截留分子量為8000～14000） 深圳晶美公司；組織搗碎機 荷蘭Philips公司；高速分散均質機 德國IKA公司；臺式高速冷凍離心機Allegra 64R，紫外/可見分光光度計DU－800 美國Beckman Coulter公司；Delta320 pH計 上海METTLER－TOLEDO儀器設備有限公司；真空抽濾系統 上海亞榮生化儀器廠；低壓層析柱（1.5cm×20cm） 上海華美實驗儀器廠；凝膠成像儀 上海天能科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 組織勻漿液的制備 屠宰后新鮮驢心，冰袋低溫保存，運輸到實驗室，樣品處理按照Joseph方法[14]，并進行適當的修改，在4℃冷庫中進行。取驢心150g，去除脂肪、結締組織后切成1cm3小塊，生理鹽水漂洗；加入400mL肌紅蛋白萃取緩沖液，移入組織搗碎機，加入少許冰塊，分多次絞碎，再用高速分散均質機以轉速15000r/min，分5次間歇均質50s，靜置萃取過夜。次日取勻漿液于4℃下6000×g離心30min，除去沉淀。取上清液，經中速定性濾紙進行真空過濾，除去殘留脂肪。加入過量鐵氰化鉀（大約1kg心肌組織加入1g鐵氰化鉀）[21]，充分反應后測定溶液總蛋白和高鐵肌紅蛋白含量。

1.2.2 分段鹽析制備高鐵肌紅蛋白粗提液 向上述制備的組織勻漿液中緩慢加入固體硫酸銨，同時使用磁力攪拌器攪拌，至70%硫酸銨飽和度，4℃萃取30min。在4℃下18000×g離心20min后，棄去沉淀，再向上清液緩慢加入固體硫酸銨至飽和，同時使用磁力攪拌器攪拌。靜置萃取30min后，于4℃下20000×g離心60min，棄上清液。沉淀用肌紅蛋白萃取緩沖液重新溶解，將溶解液于4℃，18000×g離心10min，除去不溶性物質。最后將濾液通過0.45μm濾膜過濾，在層析緩沖液A中，4℃透析24h，期間多次換液。透析液用PEG－20000濃縮。

1.2.3 高鐵肌紅蛋白的陽離子交換層析 取1.5cm× 20cm層析柱，潔凈并安裝好。將經過溶脹，并經過層析緩沖液A漂洗的CM－Sephadex Fast Flow柱料攪動倒入層析柱，并用上述緩沖溶液平衡。將經PEG－20000濃縮后的粗提液上樣至層析柱，先用層析緩沖液A洗去未結合的蛋白，再使用層析緩沖液A（100%～40%），層析液B（0%～60%）進行連續梯度洗脫。洗脫速度為0.4mL/min。280nm下自動檢測吸光值并記錄，自動收集器以每管2mL的體積自動收集洗脫液。

1.2.4 肌紅蛋白鑒定 根據肌紅蛋白已知特性，其分子量為17000左右[4]，而高鐵肌紅蛋白溶液在350～700nm范圍內有特征吸收峰[22]，故采用十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）和紫外－可見光譜掃描兩種方法對所得樣品進行鑒定。

1.2.4.1 蛋白的SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）SDS－PAGE按照Laemml方法進行，并做適當修改[23]，對肌紅蛋白粗提液、層析后各組分中蛋白質進行凝膠電泳。分離膠濃度是10%，濃縮膠濃度是5%。電泳膠片置于凝膠成像儀中進行攝像，結合Tanon軟件進行分析和處理。

1.2.4.2 紫外－可見吸收光譜分析 通過紫外－可見分光光度計對CM－Sephadex Fast Flow層析柱所洗脫下的目標峰進行光譜掃描，掃描范圍為350～700nm，掃描間隔為1nm。

1.2.5 總蛋白濃度測定和高鐵肌紅蛋白濃度測定

1.2.5.1 總蛋白濃度測定 總蛋白質濃度測定采用Bradford法[24]，按照說明書使用考馬斯亮藍試劑盒進行測定，以牛血清白蛋白（BSA）作為標準蛋白，使用紫外/可見分光光度計，于595nm波長處比色。做出標準曲線后，通過測定樣品吸光值，計算出其總蛋白濃度。

1.2.5.2 高鐵肌紅蛋白濃度測定 高鐵肌紅蛋白濃度采用Krzywicki的方法進行測定[25]，高鐵肌紅蛋白百分含量計算公式如下：

其中，R1、R2和R3分別代表A572/A525、A565/A525和A545/ A525，而A572、A565、A545和A525則分別表示測定溶液在對應不同波長下的吸光值。

2 結果與分析

2.1 CM-Sephadex陽離子交換層析

將含有肌紅蛋白的粗提液用平衡緩沖液A透析24h，上樣到CM－Sephadex Fast Flow陽離子層析柱，可見層析柱內的柱料由白色逐漸變成紅褐色。先用平衡緩沖液A洗去未結合的蛋白，結合的蛋白再用含0.5mol/L NaCl的同一緩沖液進行梯度洗脫，洗脫速度0.4mL/min。約30min記錄儀上出現第一個洗脫峰B，對應液體為無色；約140min記錄儀上出現第三個洗脫峰D，對應液體為紅褐色，250min對應的洗脫峰E液體為深紅色，見圖1。與經一次葡聚糖Sephadex G－75凝膠過濾層析得到的洗脫圖[12－13]相比，CM－Sephadex Fast Flow柱料可將肌紅蛋白粗提液充分洗脫分開，這可能與提取方法、不同層析方式，以及柱料有關[11]。

圖1 高鐵肌紅蛋白陽離子層析圖譜Fig.1 Metmyoglobin ion chromatogram

2.2 SDS-PAGE電泳

把經硫酸銨粗提后得到的高鐵肌紅蛋白粗提液及圖1中五個洗脫峰對應的洗脫樣品，進行SDSPAGE電泳實驗，結果見圖2。由圖2可知，粗提液A中不同分子量的蛋白，在經過CM-Sephadex陽離子交換柱層析后，得到很好的分離，其中層析圖中D峰對應的蛋白質分子量大約為17000。而馬心肌紅蛋白[26]、野牛心肌紅蛋白[14]、山羊心肌紅蛋白[27]等多種哺乳動物肌紅蛋白分子量均為17000左右[4]。據此初步判定層析圖中D峰即為目標肌紅蛋白峰。

此前對沙丁魚肌紅蛋白提取純化的報道中，雖然經過了兩次柱層析，仍可在電泳圖中清晰的看到雜蛋白條帶[12]，而本實驗盡管僅通過一次柱層析，卻未發現任何明顯雜蛋白條帶存在。這為更加快速精確地提取、純化電泳純高鐵肌紅蛋白提供了一條解決途徑。

圖2 電泳實驗圖Fig.2 SDS-PAGE pattern

2.3 分光光度計掃描

先前對肌紅蛋白分離、純化的報道中，幾乎都只采用一種方法，主要是SDS-PAGE電泳，對得到的樣品進行鑒定[4，27]。本實驗采用兩種方法對經過一次柱層析得到的目標樣品進行鑒定。經SDS-PAGE電泳初步鑒定后，將洗脫峰D對應洗脫液在350～700nm處進行光譜掃描。圖3的掃描圖譜顯示，該溶液在410、505、630nm處附近有特征吸收峰，這與Millar等的報道一致[22，28]。據此可進一步判定該蛋白即為高鐵肌紅蛋白。

圖3 D峰對應光譜掃描圖Fig.3 Absorption spectrum of D peak elution

2.4 高鐵肌紅蛋白得率研究

組織勻漿在加入過量鐵氰化鉀，硫酸銨鹽析和CM-Sephadex Fast Flow柱層析后，分別測定提取液總蛋白和高鐵肌紅蛋白含量，如表1所示。由于僅通過一次柱層析，最終得率高達23.8%，顯著高于經過兩次柱層析，進行豬心肌高鐵肌紅蛋白提取的得率（14.1%）[11]。

表1 高鐵肌紅蛋白純化過程Table 1 Purification process of metmyoglobin

3 結論

新鮮驢心肌經磷酸鹽緩沖液萃取后，采用70%～100%飽和硫酸銨進行分段鹽析，加入鐵氰化鉀氧化后透析，經CM-Sephadex Fast Flow陽離子交換進行一次柱層析。結果表明，層析過程中第三個洗脫峰洗脫出的蛋白質對應SDS-PAGE電泳結果為單一條帶，其分子量在17000左右；紫外/可見光光譜掃描分析表明其在410、505、630nm處有特征吸收峰，鑒定其為高鐵肌紅蛋白。這樣，僅通過一次柱交換，即可得到電泳純的高鐵肌紅蛋白，得率高達23.8%，為快速、高效提取純化高鐵肌紅蛋白提供了一條途徑。

[1]Zhang X，Kong B H，Xiong Y L.Production of cured meat color in nitrite-free Harbin red sausage by Lactobacillus fermentum fermentation[J].Meat Science，2007，77（4）：593-598.

[2]李沛軍，孔保華，鄭冬梅.微生物發酵法替代肉制品中亞硝酸鹽呈色作用的研究進展[J].食品科學，2010，31（17）：388-391.

[3]孔保華，馬麗珍.肉品科學與技術[M].北京：中國輕工業出版社，2003：71-72.

[4]Joseph P，Suman S P，Li S，et al.Mass spectrometric characterization and thermostability of turkey myoglobin[J].LWTFood Science and Technology，2010，43：273-278.

[5]Mancini R A，Hunt M C.Current research in meat color[J]. Meat Science，2005，71（1）：100-121.

[6]Chaijan M，Benjakul S，Visessanguan W，et al.Interaction betweenfishmyoglobinandmyosininvitro[J].FoodChemistry，2007，103（4）：1168-1175.

[7]Hendgen-Cotta UB，Kelm M，Rassaf T.A highlight of myoglobin diversity：The nitrite reductase activity during myocardial ischemia-reperfusion[J].Nitric Oxide，2010，22（2）：75-82.

[8]Kasaoka S，Todani M，Kaneko T，et al.Peak value of blood myoglobin predicts acute renal failure induced by rhabdomyolysis [J].Journal of Critical Care，2010，25（4）：601-604.

[9]Morita H，Sakata R，Nagata Y.Nitric oxide complex of iron（II）myoglobin converted from metmyoglobin by staphylococcus xylosus[J].Journal of Food Science，1998，63（2）：352-355.

[10]王永林，趙建生.高鐵肌紅蛋白還原酶活力與肉色穩定性關系的研究[J].肉類研究，2010（3）：21-25.

[11]湯祥明，金邦荃，曹鵬，等.豬心肌中高鐵肌紅蛋白的提取和純化[J].畜牧與獸醫，2006，38（7）：34-36.

[12]Chaijan M，Benjakul S，Visessanguan W，et al.Characterisation of myoglobin from sardine（Sardinella gibbosa）dark muscle[J]. Food Chemistry，2007，100（1）：156-164.

[13]Enoki Y，Ohga Y，Ishidate H，et al.Primary structure of myoglobins from 31 species of birds[J].Comparative Biochemistry and Physiology，2008，149：11－21.

[14]Joseph P，Suman S P，Li S，et al.Characterization of bison（Bison bison）myoglobin[J].Meat Science，2010，84（1）：71－78.

[15]孫京新，周光宏，羅欣.不同質量豬肉冷藏期間高鐵肌紅蛋白還原酶活性及相關特性變化研究[J].食品科學，2009，30（18）：389－393.

[16]王瑋，湯宇，金邦荃.豬心肌高鐵肌紅蛋白還原酶米氏方程建立與動力學研究[J].食品科學，2009，30（17）：176－180.

[17]M?ller J K S，Jensen J S，Skibsted L H，et al.Microbial formation of nitrite－cured pigment，nitrosylmyoglobin，from metmyoglobin in model systems and smoked fermented sausages by Lactobacillus fermentum strains and a commercial starter culture[J].European Food Research and Technology，2003，216（6）：463－469.

[19]G?tterup J，Olsen K，Kn?chel S，et al.Relationship between nitrate/nitrite reductase activities in meat associated staphylococci and nitrosylmyoglobin formation in a cured meat model system [J].International Journal of Food Microbiology，2007，120（1）：303－310.

[20]Polidori P，Cavallucci C，Beghelli D，et al.Physical and chemical characteristics of donkey meat from Martina Franca breed[J].Meat Science，2009，82（4）：469－471.

[21]James T Wu，Robert K Pleper，Lily H Wu，et al.Isolation and characterization of myoglobin and its two major isoforms from sheep heart[J].Clinical Chemistry，1989，35（5）：778－782.

[22]Millar S J，Moss B W，Stevensona M H.Some observations on the absorption spectra of various myoglobin derivatives found in meat[J].Meat Science，1996，42（3）：277－288.

[23]Laemmil U K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J].Nature，1970，227：680－685.

[24]Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principleofprotein－dye binding[J].Analytical Biochemistry，1976，72：248－254.

[25]Krzywicki k.The determination of haem pigments in meat [J].Meat Science，1982，7（1）：29－36.

[26]Boardman N K，Adair G S.Isolation of two myoglobins from horse－heart extracts and the determination of the molecular weight of the main component[J].Nature，1956，177（4519）：1078－1079.

[27]Suman S P，Joseph P，Li S，et al.Primary structure of goat myoglobin[J].Meat Science，2009，82（4）：456－460.

[28]Motoyama M，Kobayashi M，Sasaki K，et al.Pseudomonas spp convert metmyoglobin into deoxymyoglobin[J].Meat Science，2010，84（1）：202－207.

Extraction and purification of metmyoglobin from donkey（Equus asinus）heart muscle by single-step chromatography

LI Pei-jun，KONG Bao-hua*，ZHENG Dong-mei，CHEN Qian
（College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Myoglobin and its existing states are responsible for the color of meat and meat products，of which metmyoglobin is an important one.Myoglobin was extracted from donkey（Equus asinus）heart muscle by ammonium sulfate fractionation（70%～100%）.After oxidized by potassium ferricyanide and dialyzed，the sample solution was further purified by CM-Sephadex Fast Flow ion exchange column chromatography.The results of SDS-PAGE electrophoresis and absorption spectra analysis showed that metmyoglobin in electrophoresis pure was obtained by single column chromatography.This provided a fast and efficient way for extraction and purification of metmyoglobin.

donkey heart muscle；metmyoglobin；purification；electrophoresis pure

TS201.2+1

B

1002－0306（2012）01－0200－04

2011－01－17 *通訊聯系人

李沛軍（1986－），男，博士研究生，研究方向：畜產品加工與貯藏。

國家公益性行業（農業）科研專項經費項目（200903012－02）；東北農業大學創新專項基金（CXZ011）。