響應面法優化鼠李糖乳桿菌凍干保護劑配方的研究

許 娜，劉青梅，楊性民

（1.上海海洋大學食品學院，上海201306；2.浙江萬里學院寧波市農產品加工技術重點實驗室，浙江寧波315100）

響應面法優化鼠李糖乳桿菌凍干保護劑配方的研究

許 娜1，2，劉青梅2，*，楊性民2

（1.上海海洋大學食品學院，上海201306；2.浙江萬里學院寧波市農產品加工技術重點實驗室，浙江寧波315100）

直投式乳酸菌發酵劑的制備中，菌體在冷凍干燥過程中受損會降低發酵活力。采用響應面法結合Plackett-Burman實驗設計與最陡爬坡法，探討保護劑對鼠李糖乳桿菌的保護效果。結果表明：脫脂乳、海藻糖和甘油對菌體存活率的影響比較顯著，脫脂乳與海藻糖、海藻糖與甘油對菌體存活率的交互作用影響高度顯著，而脫脂乳與甘油的交互作用不顯著。凍干保護劑最佳配方為：脫脂乳濃度6.56g/100mL、海藻糖濃度2.35g/100mL、甘油濃度2.47g/100mL，在此條件下，菌體存活率可達86.69%，該配方有較強的實用價值。

鼠李糖乳桿菌，響應面法，凍干保護劑，菌體存活率，最優配方

鼠李糖乳桿菌是重要的發酵食品工業生產用菌，特別是在發酵酸菜等制品的加工過程中發揮著重要作用。直投式發酵劑是一種不需經過活化和擴增便能直接應用于生產的發酵劑，具有保藏周期長、活菌含量高和質量穩定性高等優點[1]，能夠顯著提高發酵食品工業的生產效率和產品質量[2]。乳酸菌發酵劑的制備通常采用真空冷凍干燥技術，在冷凍干燥過程中，必然會使部分菌體細胞受損傷、死亡及某些蛋白酶分子鈍化[3]，使發酵活力下降。凍干保護劑的添加可以有效地減少乳酸菌在冷凍干燥過程中造成的傷害，在直投式發酵劑制備的生產技術和經濟上起著核心的重要作用[4-5]。本研究根據前人經驗，選取8種公認的保護效果較好的凍干保護劑[6-8]作為實驗對象，結合Plackett-Burman實驗設計與最陡爬坡法，首先確定影響顯著因素和最大響應值的響應區域，然后建立數學模型尋找最優組合，對保護劑配方進行篩選和優化，目標是最大限度地提高菌體存活率，期望得出鼠李糖乳桿菌開發成為直投式商品發酵劑的最優配方。

表1 Plackett-Burman實驗設計及結果Table 1 Plackett-Burman experimental design and corresponding response of cell survival rate

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus） 中國工業微生物菌種保藏管理中心，編號CICC6001；MRS肉湯培養基（用于菌種的傳代、擴培和種子液制備）、MRS瓊脂培養基（用于菌落計數） 北京奧博星生物技術有限責任公司；脫脂乳粉 內蒙古伊利實業集團股份有限公司；谷氨酸鈉、海藻糖、山梨醇、甘露醇、甘油、VC、硫酸錳 國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純。

YXQ-75SII立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業有限公司；QT-2旋渦混合器 上海琪特分析儀器有限公司；SIGMA 6-16K型高速冷凍離心機、ALPHA 1-2型真空冷凍干燥儀 北京五洲東方科技發展有限公司；Formascientific-725超低溫冰箱 美國Forma scientific公司；RZX智能型恒溫培養箱 寧波江南儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 活菌體的富集與培養 將保藏的菌種經活化（10%脫脂乳粉）、傳代與擴培，制成種子液，將制備的種子液接種于MRS肉湯培養基中制備發酵液，接種量均為5%。采用搖瓶培養，37℃、120r/min，添加0.5%K2HPO4作為緩沖液，調整pH在5.2左右，培養18h。1.2.2 菌懸液的制備 將發酵液移入已滅菌的離心管中，高速冷凍離心4000r/min，4℃，20min，棄上清液，用無菌水洗滌菌體，再以同樣的條件離心，收集菌體并用無菌水調菌濃度至1010cfu/mL。

1.2.3 凍干保護劑的制備 依照實驗設計，稱取相應克數的保護劑，紫外殺菌30min，溶解于10mL無菌水中備用。

1.2.4 真空冷凍干燥條件 無菌條件下將保護劑與菌懸液混勻，-40℃冰箱中預凍2h，迅速轉移至真空冷凍干燥儀，-60℃，0.011mbar，干燥24h。

1.2.5 活菌體存活率計算 取凍干菌粉，加入與凍干前菌懸液同等體積的10%脫脂乳，復水活化30min，根據GB4789.2-2010，采用梯度稀釋平板活菌計數法，置于37℃恒溫培養箱中培養48～72h。

1.2.6 凍干保護劑優化實驗設計 以真空冷凍干燥后菌體存活率為響應目標：首先利用Plackett-Burman設計法在眾多因素中篩選出具顯著影響作用的幾種因素；然后通過最陡爬坡實驗，研究最大響應目標的響應區域；再利用Design Expert 7.0軟件，采用Box-Behnken實驗設計，進行響應面實驗，最終確定最優實驗數據，并進行結果驗證。

2 結果與討論

2.1 Plackett-Burman實驗設計篩選顯著影響因素

Plackett-Burman是一種基于不完整平衡塊為原理的實驗設計方法，它能夠以較少實驗次數準確而有效地篩選出最為重要的幾個影響因素，供進一步詳細的研究[9]。采用Minitab16.1軟件進行實驗設計和結果分析，選擇次數為N=12的實驗，針對8個因素進行研究，每種因素分別取-1、+1兩個水平，響應值為凍干后菌體存活率。實驗設計及結果見表1，各因素的效應評價見表2。

表2 Plackett-Burman實驗設計各因素的效應評價Table 2 Estimated effects of Plackett-Burman design

由表1、表2可以看出，脫脂乳、海藻糖和甘油這3個因素對菌體存活率的影響比較顯著，其中海藻糖影響最顯著，其次是甘油與脫脂乳，其他因素影響均不顯著。脫脂乳和海藻糖的t值為負，說明對響應值的影響具有顯著性負效應，添加濃度應相應地減小；甘油的t值為正，說明對響應值的影響具有顯著性正效應，添加濃度應相應地增加。

2.2 最陡爬坡實驗研究最大響應值的響應區域

通過Plackett-Burman實驗結果，篩選出了對菌體存活率具有顯著性影響作用的三個因素，即脫脂乳、海藻糖和甘油，并且分析出了爬坡方向，便于實驗確定各因素合理的水平，以逼近最大響應值的響應區域，進一步靠近最優點。最陡爬坡實驗設計及結果見表3。

表3 最陡爬坡實驗設計及結果Table 3 Experimental design of steepest ascent and corresponding results

由表3可見，通過最陡爬坡實驗確定了最大響應值的響應區域，實驗設計以表3中4號實驗為中心點，進行響應面實驗設計。

2.3 Box-Behnken實驗設計結果與響應面分析

2.3.1 實驗設計及回歸方程方差分析 以菌體存活率Y為響應值，采用Design-Expert7.0軟件中的Box-Behnken設計進行實驗設計，根據得出的實驗結果建立二次響應面回歸模型，以尋求最優實驗數據。實驗選用三因素三水平共15個實驗點的響應面法實驗，其中析因部分實驗次數為12次，中心點重復實驗次數為3次，用以估計實驗誤差。實驗設計因素及水平見表4，優化設計方案及結果見表5。

表4 Box-Behnken設計因素及水平Table 4 Variables and levels in Box-Behnken design

表5 Box-Behnken優化設計方案及結果Table 5 Box-Behnken design and corresponding results

采用Design-Expert7.0軟件對表5的實驗數據進行響應面分析，編碼值X1、X2、X3分別代表脫脂乳、海藻糖和甘油，回歸方程的方差分析結果如表6所示。

表6 回歸方程方差分析表Table 6 Analysis of variance for regression equation

由表6回歸方程的方差分析可知，回歸方程失擬項不顯著（P=0.0645）且數值較小，說明數據擬合效果較好，實驗誤差小。對上述數據進行二次回歸擬合，得到的二次回歸擬合多項式方程為：

Y=86.37＋0.69X1＋3.63X2＋0.91X3＋1.80X1X2－0.12X1X3＋1.18X2X3－1.78X12－4.49X22－1.41X32。

相關系數R2=99.43%，P＜0.0001，說明方程擬合非常好，有實際的應用意義。回歸方程模型的F檢驗極度顯著，說明擬合的多項式方程非常合適，能夠準確預測實際情況；一次項、二次項的F檢驗顯著，說明所選擇的脫脂乳、海藻糖和甘油三種因素對菌體存活率的影響都很顯著，其中海藻糖極度顯著，其次是甘油和脫脂乳；由交互項的F檢驗可知，脫脂乳與海藻糖、海藻糖與甘油對菌體存活率影響的交互作用高度顯著，而脫脂乳與甘油的交互作用不顯著。

圖1 脫脂乳和海藻糖交互作用對菌體存活率影響的響應面圖Fig.1 Response surface of interactive effects for skimmed milk and trehalose on cell survival rate

2.3.2 響應面圖及等高線圖分析 采用Design-Expert7.0軟件設計得出的響應面圖和等高線圖，可以直觀地反映各因素對響應值的影響，以及在反應過程中的交互作用影響。在等高線圖中，橢圓型或者馬鞍型的等高線表示因素之間交互作用顯著，而圓型的等高線表示因素之間交互作用較弱。

由圖1可以看出，等高線呈橢圓形，說明脫脂乳和海藻糖交互作用非常顯著。當甘油濃度在2.6g/ 100mL，脫脂乳濃度范圍在6.16～7.00g/100mL范圍內，海藻糖濃度在2.34～2.70g/100mL范圍內，可獲得高于85.41%的菌體存活率。

圖2 脫脂乳和甘油交互作用對菌體存活率影響的響應面圖Fig.2 Response surface of interactive effects for skimmed milk and glycerol on cell survival rate

由圖2可見，等高線呈圓型，說明脫脂乳與甘油交互作用不顯著，當海藻糖濃度在2.40g/100mL時，脫脂乳濃度范圍在6.25～6.95g/100mL，甘油濃度范圍在2.51～2.80g/100mL，可獲得高于85.72%的菌體存活率。

圖3 海藻糖和甘油交互作用對菌體存活率影響的響應面圖Fig.3 Response surface of interactive effects for trehalose and glycerol on cell survival rate

圖3顯示海藻糖和甘油交互作用顯著，當脫脂乳濃度為6.5g/100mL，海藻糖濃度在2.34～2.7g/100mL范圍內，甘油濃度在2.47～2.80g/100mL濃度范圍內，可獲得高于85.64%的菌體存活率。

2.3.3 結果驗證 采用Design-Expert7.0軟件，以求得最大菌體存活率為目標，在所得到的30種配方組合中分析篩選出最佳濃度配比為：脫脂乳濃度為6.56g/100mL、海藻糖濃度為2.35g/100mL、甘油濃度為2.47g/100mL，在此基礎上得到菌體存活率的理論預測值為87.49%。以篩選出的最佳濃度配比進行9組驗證實驗，平均菌體存活率值為86.69%，實測值與預測值相吻合，說明響應面法建立的數學模型準確可靠。

3 結論

由回歸方程的方差分析得出：回歸方程失擬項不顯著（P=0.0645），相關系數R2=99.43%，P＜0.0001，說明回歸方程擬合非常好，建立的數學模型有實際的應用意義；回歸方程的一次項、二次項F檢驗表明脫脂乳、海藻糖和甘油對菌體存活率的影響均比較顯著，說明篩選的因素對凍干過程中鼠李糖乳桿菌的菌體細胞有顯著保護作用；由響應面圖和等高線圖以及回歸方程交互項的F檢驗可知：脫脂乳與海藻糖、海藻糖與甘油對菌體存活率影響的交互作用高度顯著，脫脂乳與甘油的交互作用不顯著。響應面分析法得到的凍干保護劑最佳配方為：脫脂乳濃度6.56g/100mL、海藻糖濃度2.35g/100mL、甘油濃度2.47g/100mL，在此條件下，菌體存活率值為86.69%，該配方有較強的實用價值。

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Study on optimization formula of cryoprotectants for Lactobacillus rhamnosus by response surface methodology

XU Na1，2，LIU Qing-mei2，*，YANG Xing-min2
（1.College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2.Key Lab of Agricultural Processing Technology of Ningbo，Zhejiang Wanli University，Ningbo 315100，China）

In the processing of lyophilization for the directed vat set starter cultures of lactic acid bacteria，the total amount of cell population and fermentative activity was reduced.The optimization formulation of cryoprotectants for Lactobacillus rhamnosus was optimized with the way of response surface methodology which joined by Plackett-Burman design and the steepest ascend method.The results indicated that:The skimmed milk，trehalose and glycerol all significantly affected the survival rate of the Lactobacillus rhamnosus. The interaction between skimmed milk and trehalose was remarkable，so as the reaction of trehalose and glycerol，but the interaction between skimmed and glycerol.The research concluded the optimum of cryoprotectants as follows:The skimmed milk 6.56g/100mL，trehalose 2.35g/100mL，glycerol 2.47g/100mL.By using this process，the optimal cell survival rate was observed to be 86.69%，which was closed to the theory model and had the features of practicability.

Lactobacillus rhamnosus；response surface methodology；cryoprotectants；survival rate；optimization formula

TS201.1

B

1002-0306（2012）01-0207-04

2011－09－08 *通訊聯系人

許娜（1986－），女，碩士在讀，研究方向：農產品加工。

國家星火計劃項目（2010GA01009）；寧波市招標項目（2010C100017）。