高純度低聚半乳糖單一組分的制備研究

韓曉麗，蘇芳云，馮詠梅，常秀蓮，張瑞倫，劉庚鑫

（1.煙臺大學化學生物理工學院，山東煙臺264005；2.蘭州石化公司研究院，甘肅蘭州730060）

高純度低聚半乳糖單一組分的制備研究

韓曉麗1，蘇芳云2，馮詠梅1，常秀蓮1，張瑞倫1，劉庚鑫1

（1.煙臺大學化學生物理工學院，山東煙臺264005；2.蘭州石化公司研究院，甘肅蘭州730060）

采用聚丙烯酰胺凝膠Bio-Gel P-2柱對低聚半乳糖混合物進行分離純化，考察了柱溫、洗脫流速和進料量對分離的影響。結果表明，采用1.6cm×120cm凝膠柱，脫氣蒸餾水為洗脫劑，最佳操作條件為：柱溫度50℃，洗脫流速15～20mL/h，進料量3mL。此條件下，可以制備純度85%左右的三糖、四糖和五糖粗品，將一次分離產品濃縮后二次分離，得到純度98%以上的三糖、四糖和五糖單一組分，收率分別為95.5%、74.4%和96.7%，達到了標準品的純度要求。

聚丙烯酰胺凝膠，Bio-Gel P-2，低聚半乳糖，柱層析

低聚半乳糖（GOS）是以乳糖為底物，在半乳糖苷酶的作用下合成的含有3～5個單糖分子的低聚糖，具有促進雙歧桿菌增殖、礦物質的吸收、改善脂質代謝及提高人體免疫力等功能，更重要的是，GOS是母乳中的天然成分之一，這正是母乳喂養對嬰兒腸內的菌群發展和炎癥防御起重要作用的原因[1-2]，因此，GOS被大量應用于嬰幼兒食品中。目前酶法合成GOS的收率為24%～57%[3-4]，溶液中還存在相當量的乳糖、少量葡萄糖和極少量的半乳糖。本課題組曾采用納濾技術[5]、離子交換層析[6]及葡聚糖凝膠過濾層析技術[7]純化GOS混合物，這些技術都能夠有效地提高GOS的純度，但產品都是三糖、四糖和五糖的混合物，而得不到單一組分，這給科研工作者研究單一糖組分的藥物性能及食品功能性帶來很大的困難。聚丙烯酰胺凝膠可以較好地分離低聚木糖[8]和酸性低聚糖[9]等混合物，本文嘗試采用Bio-Gel P-2對GOS混合物進行分離提純，探討了各種因素對其分離的影響，確定了最佳的分離條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

聚丙烯酰胺凝膠Bio-Gel P-2 Bio-Rad公司；GOS混合物 由煙臺華海生物制品有限公司提供，經NF-3（美國Sepro公司）納濾膜分離純化濃縮后，HPLC分析其質量濃度為340mg/mL，組成為葡萄糖7.12%、乳糖40.38%、GOS 52.50%。

Agilent 1200 高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；帶夾套層析柱 1.6cm×120cm（體積約240mL），上海華美儀器有限公司；BSZ-160F自動部分收集器 上海精科實驗儀器有限公司；DGL-2002型電熱鼓風干烘箱 龍口先科儀器有限公司；SC-15數控超級恒溫槽 寧波天恒儀器廠。

1.2 柱層析分離

100g Bio-Gel P-2凝膠室溫下溶脹24h，傾出上層細小顆粒，抽真空脫氣后自動沉降法裝入1.6cm× 120cm的層析柱中，裝填高度為110cm，由超級恒溫水浴控制層析柱溫度，由自動收集器收集洗脫液。在分離過程中，采用脫氣的去離子水為流動相。

1.3 HPLC分析方法

各種糖組分的含量采用HPLC分析測定。色譜條件：G1362A示差折光檢測器；Aichrom-NH2色譜柱（4.6mm×250mm）；流動相為乙腈水混合液，體積比為77∶23；流速1.0mL/min；進樣量：20μL，柱溫25℃。

1.4 薄層層析法

采用自制的GF硅膠薄板。展開劑為V正丁醇∶V乙醇∶V水＝5∶3∶2，顯色劑：1g二苯胺，1mL苯胺，50mL丙酮和5mL 85%磷酸混合，85℃顯色15min。

2 結果與討論

2.1 操作條件對分離的影響

圖1 不同溫度下Bio-Gel P-2對低聚糖的分離效果Fig.1 The separation effect of Bio-Gel P-2 on GOS under different temperature

圖2 溫度對低聚半乳糖黏度的影響Fig.2 Effect of temperature on viscosity of GOS

2.1.1 柱溫對分離的影響 GOS的熱穩定性非常好，180℃下長時間加熱不會發生分解[1]。取待分離的GOS混合物3mL上樣，洗脫流速為15mL/h，分別在18、50、70℃下進行分離操作，洗脫液每3mL收集一管。結果發現50℃和70℃的分離效果很相似，18℃和50℃的分離效果見圖1，依次流出的為五糖、四糖、三糖、乳糖和葡萄糖。

由圖1可以看出，升高溫度對分離有利。隨著溫度的升高，各種糖組分之間的選擇性雖然相差不大，但高溫下各種糖組分之間的分離度明顯高于低溫下的數據。這是因為隨著溫度的升高，流動相和物料的黏度都隨之降低，具有更好的流動性，因而分離度明顯提高。溫度對低聚半乳糖混合物黏度的影響見圖2。由圖2可以看出，溫度由18℃升至50℃時，低聚糖的黏度由7.0mPa·s快速降至2.0mPa·s，而后隨溫度的升高，低聚糖的黏度平緩降低，變化不大，因此，50℃和70℃下低聚糖的分離效果相差不大。

2.1.2 洗脫流速對分離的影響 由于聚丙烯酰胺凝膠Bio-Gel P-2的粒徑較細，為45～90μm，因此柱壓較高，要維持柱子長時間處于穩定操作狀態，流動相的最大流速只能達到25mL/h，因此在柱溫50℃下，比較了洗脫流速15、20、25mL/h下的分離效果，結果發現，在這種窄范圍內的流速下，分離效果相差不大。與15mL/h的分離效果相比，25mL/h的分離效果稍稍遜色，薄板層析圖見圖3，左邊兩個點分別為葡萄糖和乳糖標準樣，43管之前為微量的低聚六糖，43管之后依次流出的為低聚五糖、四糖、三糖、乳糖和葡萄糖。

圖3 流速25mL/h下聚丙烯酰胺分離的薄板層析圖Fig.3 The thin layer chromatography chart of polyacrylamide gel at 25mL/h

2.1.3 進料量對分離的影響 洗脫流速20mL/h，進料量分別為3、4.5、6mL時進行分離操作，考慮到增加進料量會影響洗脫速度，因此洗脫溫度均采用70℃。將各個條件下收集的糖組分進行薄板層析，根據層析圖決定低聚三糖、四糖和五糖收集的范圍，將收集的各種糖組分進行HPLC分析，各種糖組分的純度及收率見表1。

表1 進料量對低聚糖分離效果的影響（%）Table 1 The separation effect of sample volume on GOS（%）

從不同進料量的薄板層析圖（圖略）明顯可以看出，隨著進料量的增加，各種糖組分之間的分離度明顯降低，特別是四糖與三糖、三糖與乳糖之間交叉的幅度增大，導致三糖的純度和收率急劇下降（見表1）；收集的低聚四糖和五糖的純度差別不大，但其收率明顯降低。因此，本實驗條件下，適宜的進料量是3mL。

2.2 低聚半乳糖單一組分的制備

在操作溫度為50℃，洗脫流速為20mL/h，進料量為3mL的條件下，將聚丙烯酰胺凝膠柱層析多次分離GOS混合物得到的三糖、四糖和五糖粗品分別混勻，三糖混合物中含有乳糖、三糖和四糖，HPLC分析知其質量分數分別為4.3%、87.4%和8.3%；四糖混合物中含有三糖、四糖和五糖，其質量分數分別為12.5%、82.7%和4.8%；五糖混合物中含有四糖、五糖和少量六糖，其質量分數分別為7.9%、90.0%和2.1%，將三糖和四糖混合物濃縮至質量濃度340g/L左右，五糖混合液濃縮至質量濃度150g/L左右，分別上柱進行二次分離，分離條件與一次分離條件相同，各種糖組分分離的結果見圖4。

圖4 聚丙烯酰胺凝膠柱對三糖、四糖和五糖的二次分離Fig.4 The second column chromatography of polyacrylamide gel to tri-,tetra-and pentasaccharide

由圖4（A）可以看出，首先洗脫出的是四糖，然后依次是三糖和乳糖。由于混合物中四糖和乳糖的含量較少，因而三者之間分離效果較好，大部分三糖都集中在51～57管共21mL的溶液中，收集這部分溶液，得到質量分數98.1%的低聚三糖組分，滿足分析標準品的純度要求，同時，三糖的收率也很高，達到95.5%。由圖4（B）可以看出，四糖與五糖的分離效果較好，與三糖分離效果稍差，這是由于粗品混合物中的三糖含量相對偏高引起的。為了得到純度較高的四糖標準品，收集48～51管中的溶液，得到質量分數98.3%的低聚四糖組分，達到了分析用標準品的純度要求，四糖的收率為74.4%。由圖4（C）可以看出，由于混合物中六糖和四糖的含量都很低，因而三種糖組分之間的分離效果都較好，收集43～46管中的溶液，得到五糖，其質量分數為98.7%，收率為96.7%。

3 結論

利用聚丙烯酰胺凝膠Bio-Gel P-2柱層析分離低聚半乳糖混合物，層析柱1.6cm×120cm分離的最佳操作條件是：蒸餾水為洗脫劑，操作溫度50℃，洗脫流速15～20mL/h，進料量3mL。最佳分離條件下制備的三糖、四糖和五糖的純度分別為84.5%、85.1%和87.9%，收率分別為85.9%、86.4%和88.7%。將收集的各種組分濃縮后二次分離，制備的三糖、四糖和五糖單一組分的純度分別為98.1%、98.3%和98.7%，收率分別為95.5%、74.4%和96.7%，達到了分析用標準品的純度要求。

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Study on preparation of high purity of galacto-oligosaccharides single components

HAN Xiao-li1，SU Fang-yun2，FENG Yong-mei1，CHANG Xiu-lian1，ZHANG Rui-lun1，LIU Geng-xin1
（1.College of Chemistry and Biology，Yantai University，Yantai 264005，China；2.Research Institute of Lanzhou Petrochemical Company，Lanzhou 730060，China）

Bio-Gel P-2 gel filtration chromatographic column was used for the purification of Galactooligosaccharides（GOS）mixture，by which the effect of column temperature，elution flow-rate and sample volume on the separation were studied.The results showed that the optimum separation could be obtained at 50℃，15～20mL/h and sample volume 3mL with the column of 1.6cm×120cm and elution solution of degassed distilled water.Products of tri-，tetra-and pentasaccahride with the purity of more than 85%were achieved under this condition.Followed the second column chromatography for the concentrate of above single products，more than 98%purity and the yield of 95.5%，74.4%and 96.7%of tri-，tetra-and pentasaccharide，respectively，were obtained，which could meet the requirements of the standardized sample.

polyacrylamide gel；Bio-Gel P-2；galacto-oligosaccharides；column chromatograph

TS201.2+3

B

1002-0306（2012）01-0238-03

2011－01－17

韓曉麗（1962-），女，大學本科，副教授，主要從事化工和生化分離方面的研究。

山東省科技攻關項目（2008GG10002043，2007GB01008）。