8種葉片葉綠素提取得率、穩定性和應用效果的對比

劉鄰渭，袁 琳，孫麗芳，唐麗麗

（1.西北農林科技大學食品學院，陜西楊凌712100；2.陜西省楊凌職業技術學院，陜西楊凌712100）

8種葉片葉綠素提取得率、穩定性和應用效果的對比

劉鄰渭1，袁 琳1，孫麗芳1，唐麗麗2

（1.西北農林科技大學食品學院，陜西楊凌712100；2.陜西省楊凌職業技術學院，陜西楊凌712100）

以8種葉片為原料，對葉綠素相對提取得率、提取物的穩定性以及在食品應用的效果進行了對比研究。結果表明：葉片干燥方法對原料的提取得率有一定影響；以80%乙醇為提取劑于50℃下提取葉綠素相對較佳；從菠菜、青菜、雪松、令箭荷花、海桐、石楠、冬青、女貞提取葉綠素的得率依次降低；陽光直射、pH降低和溫度升高加快提取液中葉綠素的降解；多數葉片提取物的降解變化趨勢總體相同，青菜和令箭荷花葉片提取物的變化顯示出某些個性特點；添加葉綠素制作湯圓、果凍和糖果時效果良好，而制作冰淇淋和酸奶時效果較差。

葉綠素，提取，穩定性，應用

葉綠素是良好的天然食用色素，近年來，有關研究指出葉綠素具有抵抗輻射、強健肌肉、造血、解毒、抗炎、抗氧化、抗衰老、抗癌、減緩化療負作用、維持血細胞健康等保健作用[1-13]，因而興起了生產葉綠素保健品的勢頭。目前，提取葉綠素的原料以蠶砂、竹葉和大麥苗等為主，而研究過的其它原料還包括菠菜、芹菜、萵筍、甘藍、油菜、豆芽菜苗、青草、三葉草、仙人掌、蘆薈、甘蔗葉、甜菜葉、海藻、螺旋藻、浮萍、茶葉、多種竹葉、桑葉、松針、香蕉葉、獼猴桃葉、桃葉、大葉黃楊、絞股藍葉、牡丹葉和紫丁香葉等[12-31]。然而，同時從多種原料中提取葉綠素并測試其穩定性的比較研究卻鮮見報道。為此，本文以兩種喬木葉片、三種灌木葉片、一種花卉葉片和兩種蔬菜葉片為原料，以乙醇水溶液為提取溶劑，以提取液和處理液在特定波長下的吸光度表示其葉綠素含量，比較了這些葉片葉綠素的相對提取得率、穩定性和食品應用效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

喬木葉片-女貞、雪松葉片，灌木葉片-海桐、石楠、冬青葉片，花卉葉片-令箭荷花葉片，蔬菜葉片-菠菜、青菜葉片 均采自西北農林科技大學冬季的校園；95%乙醇、無水乙醇、檸檬酸 均為分析純，市售。

電熱鼓風干燥機，粉碎機，電子天平，水浴鍋，721型分光光度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 葉綠素的提取及方法優化

1.2.1.1 原料的預處理 方法一：將洗凈、瀝水、擦干的8種新鮮葉片分別攤開放置于陰涼處，陰干，粉碎，過60目篩后備用。方法二：將洗凈、瀝水、擦干的8種新鮮葉片分別攤開放置于電熱鼓風干燥箱中，40℃烘干，粉碎，過60目篩后備用。

1.2.1.2 95%乙醇提取陰干葉葉綠素 準確稱取按照1.2.1.1方法一預處理的8個樣品各0.2g，分別置于8支試管中，各加3mL 95%乙醇，用橡皮塞塞好，振蕩三次，在40℃的水浴條件下浸提2h，隨后分別過濾到8個25mL的容量瓶中，用95%乙醇定容后，測定吸光度。

1.2.1.3 采用乙醇水溶液提取陰干葉葉綠素 將1.2.1.2的提取方法中的稱樣量由0.2g更改為0.1g，將95%乙醇提取劑分別改變為40%、60%、80%乙醇水溶液，將定容溶劑改為80%乙醇，其它操作同1.2.1.2。

1.2.1.4 采用不同干燥方法提取葉綠素 準確稱取按照1.2.1.1方法一和方法二預處理的16個樣品各0.1g，以80%乙醇水溶液為提取劑，其它操作同1.2.1.2。

1.2.1.5 采用不同溫度提取葉綠素 準確稱取按照1.2.1.1方法一預處理的雪松、女貞、冬青和石楠以及按照1.2.1.1方法二預處理的海桐、令箭荷花、波菜和青菜干燥葉粉樣品各0.1g（每種樣品取兩份），分別置于等大16支試管中，加3mL 80%乙醇，用橡皮塞塞好，振蕩三次，然后將每一相同的兩份樣品分置于40℃和50℃水浴中浸提2h，隨后分別過濾到16個25mL的容量瓶中，用80%乙醇定容后，測定吸光度。

1.2.2 葉綠素相對穩定性實驗

1.2.2.1 提取液的準備 按照1.2.1.5中50℃水浴的提取方法，但將葉粉稱樣量和提取劑用量分別加大10倍，以及將提取時間改為1h，提取后過濾、定容至50mL，共得到8種葉子的葉綠素提取液。

1.2.2.2 不同pH下葉綠素的穩定性實驗 檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液的配制：將配制的0.2mol/L檸檬酸乙醇水溶液和0.1mol/L磷酸氫二鈉乙醇水溶液按照一定比例配制成pH分別為2.2、3.8、5.0、6.0、7.0、8.0的緩沖溶液。

實驗方法：按照pH從低到高的順序分別將6種pH緩沖溶液加到6組大試管中，每組8支試管，每管7mL，然后，分別將1.2.2.1制備的8種葉子的葉綠素提取液各3mL移加到這6組共48個大試管中，塞好橡皮塞，振蕩搖勻，放置于暗室，30min后取出，測定吸光度。

1.2.2.3 不同加熱溫度下葉綠素的穩定性實驗 分別將1.2.2.1制備的8種葉子的葉綠素提取液各5mL移加到8支大試管中，在65、75、85、95℃四種溫度下水浴加熱30min后取出，轉入暗室冷卻后，各加80%乙醇定容為15mL，測定吸光度。

1.2.2.4 不同光照條件下葉綠素的穩定性實驗 分別將1.2.2.1制備的8種葉子的葉綠素提取液各30mL移加到8個50mL的錐型瓶中，于中午12時放置于戶外光照5min，取出5mL用80%乙醇定容為15mL后，測定吸光度，其余放入暗室，第2d取出，按前1d的處理和測定方法再做一次，第3d和第4d按同樣處理和測定方法各再做一次。

1.2.3 葉綠素含量、相對提取得率和相對穩定性的測定 葉綠素最強的可見光吸收區有兩處，即波長640～660nm的紅光吸收區和430～450nm的藍紫光吸收區，因此，葉綠素溶液在兩區內的最大吸收和其濃度均成正比。依據這一原理，本研究將1.2.1中不同提取液和1.2.2中不同處理液作為兩類試樣，分別在436nm和666nm波長下測定各試樣的吸光度，并根據所有試樣制備時料液比相同，用試樣吸光度表示其葉綠素的相對含量，用提取液的吸光度表示葉綠素的“相對提取得率”，用處理試樣的吸光度變化趨勢表示葉綠素的“相對穩定性”。

1.2.4 葉綠素提取物在食品中的應用實驗 按照1.2.1優選的方法，分別提取8種葉片的葉綠素，提取液過濾濃縮后放入暗室備用。然后按照傳統食品加工工藝，并適量添加葉綠素，試制成食品，通過感官評比，比較不同葉片葉綠素在不同食品中的應用效果。

2 結果與分析

2.1 不同葉片葉綠素相對提取得率的初次對比

按1.2.1.2的方法制備好的葉綠素提取液的比色測定結果見表1。

表1 以95%乙醇為提取劑提取陰干葉片時葉綠素的相對提取得率Table 1 Relative yields of chlorophyll extracted with 95% ethanol from shade dried leaves

表1顯示，由8種葉片提取葉綠素溶液的吸光度的大小順序為：菠菜＞青菜≈雪松＞令箭荷花＞石楠＞海桐＞冬青＞女貞。這種排序可能和不同葉片中的葉綠素含量、提取條件、干燥方法以及不同葉片的組織結構、細胞壁厚度等有關。

2.2 不同提取劑提取葉綠素時相對提取得率的對比

按1.2.1.3的方法制備好的葉綠素提取液的比色測定結果見表2。

表2顯示，隨著提取溶劑乙醇濃度的升高，提取液的吸光度也隨之明顯升高，采用80%乙醇時的相對提取得率最高。比較表1和表2的數據并考慮到1.2.1.3實驗使用的原料只有1.2.1.2實驗使用的原料的一半，可以確定，使用80%乙醇比使用95%乙醇為提取劑時的相對提取得率高。所以80%乙醇為優選提取劑。

表2 乙醇濃度對葉綠素相對提取得率的影響Table2 Influenceofethanolconcentrationonthechlorophyllyield

2.3 不同干燥方法對相對提取得率的影響

按1.2.1.4的方法制備好的16種提取液的比色測定結果見表3。

表3 葉片干燥方法對葉綠素相對提取得率的影響Table 3 Influence of the leaf drying methods on the chlorophyll yield

表3的數據顯示，無論從436nm波長處的吸光度，還是從在666nm波長處的吸光度看，陰干的女貞、雪松、冬青、石楠葉片的葉綠素提取得率高于烘干的，而烘干海桐、令箭荷花、菠菜和青菜葉片的葉綠素提取得率明顯高于陰干的。

2.4 提取溫度對相對提取得率的影響

表4 提取溫度對葉綠素相對提取得率的影響Table 4 Influence of extraction temperature on the chlorophyll yield

按1.2.1.5的方法制備好的16種提取液的比色測定結果見表4。

表4顯示，隨著提取溫度由40℃改為50℃，提取液吸光度都有一定的提高，即葉綠素的相對提取得率增加。比較表1～表4中的吸光度可知，按照1.2.1.5方法包含的其他提取條件，并采用50℃提取，是本文優選的最佳提取條件。在此條件下，從8種葉片提取葉綠素的相對得率的高低順序為：菠菜＞青菜＞雪松≈令箭荷花＞海桐＞石楠＞冬青＞女貞。

2.5 pH對提取液葉綠素穩定性的影響

按照1.2.2.2實驗結果見圖1和圖2。

圖1 8種葉片葉綠素提取液在不同pH下吸光值（A436nm）的變化Fig.1 OD436nmof the extracted solutions from 8 kinds of leaves under different pH

圖2 8種葉片葉綠素提取液在不同pH下吸光值（A666nm）的變化Fig.2 OD666nmof the extracted solutions from 8 kinds of leaves under different pH

圖1和圖2顯示，8種葉片的提取液經調整pH后放入暗室30min，其葉綠素的兩個主要吸收峰都有所下降，pH越低，下降越快；除了青菜源葉綠素提取液在436nm下的吸光度變化為曲線外，其它葉片提取液吸光度的變化曲線基本都為較陡的直線。

2.6 溫度對提取液中葉綠素穩定性的影響

圖3 8種葉片葉綠素提取液在不同溫度值下吸光值（A436nm）的變化Fig.3 OD436nmof the extracted solutions from 8 leaves under different temperature

按照1.2.2.3制備樣品后，分別在436nm和666nm波長下測定吸光度后，以溫度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，分別制出圖3和圖4。

在“雙創”時代背景下，高職院校教師必須與時俱進，不斷提高自身的核心素養和能力，為學生做出良好的榜樣，為培養出滿足“雙創”型人才奠定堅實基礎。高職教師核心素養和能力［2］主要包括高職教師的教育理念與師德素養、教學和教改能力、專業實踐和指導能力、信息化應用及科研能力、創新創業能力等。高職院校應該充分地利用“政校行企”四方聯動的模式，構建雙創型的教師隊伍，促進教師核心素養和能力的全面提升。

圖3和圖4顯示，8種葉片的提取液經加熱30min后，其葉綠素的兩個主要吸收峰都有所下降，加熱溫度越高，下降越快；除了令箭荷花葉片葉綠素提取液的吸光度隨溫度升高較快下降外，其它7種葉片提取液在前四種溫度范圍內吸光度的變化曲線基本都為較平的直線，而98℃處理后的降幅一般有所加大。

圖4 8種葉片葉綠素提取液在不同溫度值下吸光值（A666nm）的變化Fig.4 OD666nmof the extracted solutions from 8 leaves under different temperature

2.7 光照對提取液中葉綠素穩定性的影響

按照1.2.1.3制備樣品后，分別在436nm和666nm波長下測定吸光度，以凈光照時間累積值為橫坐標，以吸光度為縱坐標，分別制出圖5和圖6。

圖5 8種葉片葉綠素提取液在不同光照時間處理后吸光值（A436nm）的變化Fig.5 OD436nmof the extracted solutions from 8 leaves exposed to sun for different time

圖6 8種葉片葉綠素提取液在不同光照時間處理后吸光值（A666nm）的變化Fig.6 OD666nmof the extracted solutions from 8 leaves exposed to sun for different time

圖5和圖6顯示，雖然每天實驗的光照時間都只是短短的5min，但隨著光照的進行，8種葉片葉綠素提取液的吸光度顯著降低；隨著累積光照時間延長，8種葉片葉綠素提取液在兩種波長下的吸光度基本都呈曲線下降（唯有青菜葉片提取液在436nm下的吸光度幾乎呈直線下降），說明前兩次的5min光照對葉綠素的降解作用最強。

2.8 葉綠素提取物在食品中的應用效果比較

加入各種葉片葉綠素的湯圓煮熟后皆為綠色，其中加菠菜葉綠素的湯圓色澤最為鮮艷翠綠。

加入各種葉片葉綠素的酸奶開始時都呈現出淡淡的綠色，低溫保存短期內不明顯褪色，但總體感官效果都較差。

加入各種葉片葉綠素的果凍色澤皆為翠綠，透明度較好，與添加人工色素制成的果凍相比，其綠色顯得更為自然。

添加了各種葉片葉綠素的糖果顏色自然鮮綠，透明度好。

3 結論與討論

3.1 結論

陰干的女貞、雪松、冬青、石楠葉片的葉綠素提取率略高于烘干的，而烘干海桐、令箭荷花、菠菜和青菜葉片的葉綠素提取率明顯高于陰干的；采用料液比為1∶30，以80%乙醇為提取劑，于50℃下提取葉綠素是本文選出的相對最佳提取條件。

在本文選出的最佳提取條件下，由8種葉片提取葉綠素的相對得率的大小順序為：菠菜＞青菜＞雪松≈令箭荷花＞海桐＞石楠＞冬青＞女真。

8種葉片的葉綠素提取液對光照都極為敏感，短時間日光直射即可引起大幅褪綠。

8種葉片的葉綠素提取液對pH都較為敏感，隨著pH降低，穩定性近乎線性降低。

在86℃以下，除了令箭荷花葉片外，其它葉片的葉綠素提取液對加熱不敏感，但溫度上升至98℃以上，多數葉片葉綠素降解明顯加快，唯有菠菜葉片葉綠素提取液仍很穩定。

葉綠素加入湯圓、糖果和果凍的效果良好，加入冰淇淋和酸奶中的效果不理想。

3.2 討論

從本文研究結果中看，葉片干燥方法可能是影響葉綠素提取得率的一個重要因素，而且不是由水分含量差異引起。這是因為，如果陰干葉片和烘干葉片水分含量的不同是提取得率不同的主要原因，那么實驗結果應該是，8種葉片陰干提取得率都高，或是8種葉片烘干提取得率都高。

從本文的研究結果看，從不同原料提取葉綠素的得率有一定差異。這肯定與原料的葉綠素含量不同有關，但也和不同葉片提取時的pH之間差異有關。

從本文的研究結果看，多數葉片提取液中葉綠素在環境條件影響下的降解趨勢彼此基本一致，但個別葉片提取液中葉綠素的穩定性可表現出一定特殊性，例如，菠菜提取液中葉綠素熱穩定性高、令箭荷花提取液中葉綠素熱穩定性低，這可能與菠菜堿性相對較高，有利于葉綠素穩定有關；葉綠素處于乙醇水溶液中時特別易于光降解。事實上，前人在研究菠菜汁葉綠素穩定性時已發現，葉綠素對紫外光的敏感性遠大于對pH、溫度和氧含量的敏感性[32]，前人在研究對比葉綠素含量的不同測定方法時也已發現，用乙醇-丙酮-水混合液比用乙醇-丙酮混合液、用無水乙醇、二甲亞砜等為溶劑時更易發生光氧化[33]。

從本文應用葉綠素實驗效果可推知，將葉綠素提取物加入到較為透明的低酸食品中，可帶來美麗的綠色，并具有一定穩定性；但將葉綠素提取物加入到以水為介質的粗分散系或酸性食品中的效果不佳，這可能是因為葉綠素水溶性差和具有酸不穩定性，粗分散顆粒的光散射作用也減少了葉綠素的色感。

[1]鄭國棟，歐陽文，顏苗，等.葉綠素及其衍生物的藥理研究進展[J].中南藥學，2006，4（2）：146-148.

[2]李月，樊軍文，陳志龍.葉綠素衍生物的生物活性研究進展[J].藥學實踐雜志，2001，19（5）：266-269.

[3]柳新平，王新明，周開文，等.葉綠素在腫瘤防治中的應用研究進展[J].中國腫瘤臨床與康復，2007，14（3）：269-271.

[4]肖文劍，王新明.葉綠素在惡性腫瘤淋巴切除術中應用的研究進展[J].中國腫瘤臨床與康復，2005，12（5）：466-468.

[5]傅娟，蔣義國.葉綠酸抗腫瘤作用及其機制的研究[J].腫瘤防治雜志，2004，11（2）：195-198.

[6]紀衛東，蔣義國，王敏，等.葉綠酸對反式-7，8-二羥-9，10-環氧苯并芘抗細胞轉化活性的影響[J].中華預防醫學雜志，2003，37（5）：335-337.

[7]Barrington L.The Importance of Chlorophyll in our Diets. Natural Body Healing，2011.http：//www.naturalbodyhealing.com/ importance_of_chlorophyll.html.

[8]Ross.Health Benefits of Liquid Chlorophyll.Energise Alkaline Dietamp;Natural Health Blog，February 11，2009.http：//www. energiseforlife.com/wordpress/2009/02/11/health-benefits-ofliquid-chlorophyll/comment-page-1/.

[9]Egner PA，Wang JB，Zhu YR，et al.Chlorophyllin intervention reduces aflatoxin-DNA adducts in individuals at high risk for liver cancer[J].Proc Natl Acad Sci，2001，98（25）：14601-14606.

[10]Egner PA，Munoz A，Kensler TW.Chemoprevention with chlorophyllin in individuals exposed to dietary aflatoxin[J]. Mutation Research，2003：209-216，523-524.

[11]Moiseeva MV，Mikhailesc GA.Application of chlorophyll derivatives in medicine.In edition “Study and application of therapeutic-prophylactic medications based on natural biologically active compounds.”[M].Edited by V G Bespalov and V B Nekrasova，SPb Eskulap，2000：80-87.

[12]黃持都，胡小松，廖小軍，等.葉綠素研究進展[J].中國食品添加劑，2007（3）：114-118.

[13]關錦毅，郝再彬，張達，等.葉綠素提取與檢測及生物學功效的研究進展[J].東北農業大學學報，2009，40（12）：130-134.

[14]楊國恩，吳志平，李坤平，等.竹葉葉綠素的提取及其性質的穩定性[J].中南林學院學報，2005，25（3）：106-110.

[15]金春雪，金曉紅，龍林.蠶砂中葉綠素的提取及葉綠素銅鈉的制備[J].信陽師范學院學報：自然科學版，2000，13（1）：88-90.

[16]楊桂枝.從海藻中提取、制備葉綠素銅鈉鹽工藝及穩定性研究[D].天津：天津科技大學，2005.

[17]陳正，劉常坤.超聲波萃取菠菜葉中葉綠素的研究[J].化學與生物工程，2004（6）：37-38，56.

[18]劉絢霞，董振生，劉創社，等.油菜葉綠素提取方法的研究[J].中國農學通報，2004，20（4）：62-63.

[19]孫永林，楊瑞.芹菜葉制取葉綠素銅鈉鹽的工藝研究[J].長江蔬菜，2010（4）：36-38.

[20]孟慶廷，郭慶軍，孫玉紅，等.微波萃取甘藍葉綠素工藝研究[J].山東化工，2009（2）：1-3，7.

[21]馬士成，于海寧，沈生榮.茶綠色素的制備及其穩定性研究進展[J].茶葉，2007，33（1）：11-15.

[22]王立娟.超聲波輔助提取紫丁香葉葉綠素的工藝[J].農業工程學報，2009，25（S1）：171-174.

[23]陳雪峰，劉迪.超臨界CO2萃取桃葉中葉綠素的工藝研究[J].食品科技，2006（5）：38-41.

[24]麻明友，麻成金，肖桌柄，等.獼猴桃葉中葉綠素的提取研究[J].食品工業科技，2006，27（6）：140-143.

[25]張志強，楊清香.三葉草中葉綠素提取方法的研究[J].中國食品添加劑，2008（5）：126-129.

[26]王冬李，建華祝，錫鍵，等.仙人掌葉綠素提取工藝研究[J].安徽農學通報，2006，12（5）：67-68.

[27]于相麗，胡秋孌，黃宇.牡丹葉綠素的提取及其性質研究[J].洛陽師范學院學報，2005（5）：107-109.

[28]吳光旭，陳東海，俞勝.絞股藍葉綠素銅鈉鹽的制備和理化性質研究[J].食品研究與開發，2006，27（7）：203-205.

[29]丁利君，周燕芳，謝曉玲.芥藍葉制取葉綠素銅鈉鹽的工藝參數及其性質研究[J].現代食品科技，2005，27（1）：36-38.

[30]王曉飛，郭海蓉，李志春，等.微波輔助提取甘蔗糖廠濾泥中葉綠素的初探[J].現代食品科技，2008，24（1）：59-63.

[31]王爽，姚秉華.超聲法提取松針葉綠素及穩定性研究[J].紡織高校基礎科學學報，2010，23（1）：87-90.

[32]孫鶴，叢培君，王榕樹，等.綠色蔬菜汁中葉綠素穩定性研究[J].食品科學，1997，18（2）：9-13.

[33]李英華，呂秀陽，任浩明，等.葉綠素及其衍生物的分析方法研究進展[J].蠶桑學報，2004，35（4）：1-5.

Comparison of extraction rates，stabilities and application properties of chlorophyll from 8 kinds of leaves

LIU Lin-wei1，YUAN Lin1，SUN Li-fang1，TANG Li-li2
（1.College of food Science and Technology，Northwest Agriculture and Forestry University，Yangling 712100，China；2.Shaanxi Yangling Vocational and Technical College，Yangling 712100，China）

Chlorophyll was extracted from 8 kinds of dried leaves respectively.And the yields，stability and application effect were compared with each other.The results showed that：extraction yields for some leaves relied significantly to the leaves’drying method.The optimized extraction temperature and agent were 50℃and 95%alcohol solution.The extraction yields turned from the highest to the lowest one by one when the raw materials were spinach，greens，deodarcedar，nopalxochia ackermannii，pittosporum tobira Ait，photinia serrulata，holly，and ligustrum lucidum Aitleaves respectively.Chlorophyll in those extraction solutions degradated accelerately when exposing to sun light，lower pH and high temperature.The chlorophyll stabilities in most extracts were similar generally，but for the extracts from greens and nopalxochia ackermannii，which displayed somewhat differences.Adding concentrated extracts to glutinous rice ball，jelly and candy had gotten good results，but adding them to ice-cream and yogurt had not.

chlorophyll；extraction；stability；application

TS201.1

B

1002-0306（2012）01-0245-05

2010－07－16

劉鄰渭（1953-），男，教授，主要從事食品化學研究。