蛹擬青霉發酵菌絲體中蟲草酸的提取與測定

邵 穎，李 文，王 陶

（徐州工程學院食品生物工程學院，江蘇徐州221008）

蛹擬青霉發酵菌絲體中蟲草酸的提取與測定

邵 穎，李 文，王 陶

（徐州工程學院食品生物工程學院，江蘇徐州221008）

蟲草酸，即D-甘露醇，是蟲草類真菌中的主要有效成分之一。為更好開發蛹蟲草資源，研究了蛹擬青霉發酵菌絲體中蟲草酸的提取工藝。依據大量單因素實驗以及正交實驗得出最佳提取條件為：微波時間80s，微波功率200W，料液比1∶100，乙醇濃度70%。在此條件下，對實驗室20株蛹擬青霉進行了蟲草酸的測定，結果表明22號菌株蟲草酸含量高達160.39mg/g，有一定的生產應用價值。

蛹擬青霉，蟲草酸，微波提取

蛹蟲草又名北冬蟲夏草、北蟲草等，含有多種氨基酸，其藥理作用與冬蟲夏草相似，對神經系統及心血管等疾病具有治療效果，并有抗腫瘤和抗衰老等作用[1]。蟲草酸，即D-甘露醇，化學分子式C7H12O6，為1，3，4，5-四羥基環已酸[2]。蟲草酸含量的高低是衡量蟲草質量的主要標準之一，一般認為蟲草酸含量高的蟲草的藥用價值高[3]。蟲草酸能抑制各種病菌的成長，具有利尿脫水、提高血漿滲透壓、鎮喘祛痰、抗自由基等藥理作用，蟲草酸能保肺益腎、止血化痰，明顯增強支氣管纖毛活動能力，調節支氣管平滑肌，蟲草酸能降低血液中膽固醇、甘油三脂的含量，預防血栓的形成，并且對多種疾病有一定的療效。甘露醇現已被認為是發酵蟲草菌絲體中活成分的重要測試指標[4-9]。本文以實驗室多株蛹擬青霉菌株為研究對象，通過單因素及正交實驗來確定蛹擬青霉菌絲體蟲草酸的最優微波提取工藝條件，利用紫外分光光度法對不同菌株的菌絲體中蟲草酸含量比較來確定高產菌株，為蛹蟲草資源的進一步開發、應用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛹擬青霉（Cordyceps militaris）菌株（13號為原始菌株，其余菌株為13號菌株經低能離子束誘變后獲得的生長性狀較好的正變株） 由徐州工程學院食品工程學院實驗室保存；D-甘露醇 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；高碘酸鉀 分析純，天津市北方天醫化學試劑廠；其他試劑 均為分析純；斜面培養基 SDAY培養基（葡萄糖4%，蛋白胨1%，酵母浸膏1%，瓊脂2%）；液體培養基 SDY培養基（葡萄糖4%，蛋白胨1%，酵母浸膏1%）；發酵培養基 SDY培養基（葡萄糖4%，蛋白胨1%，酵母浸膏1%）。

CW-2000超聲波微波協同萃取儀 新拓微波溶洋測試技術有限公司；TU-1810紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；HH.B11.600-S-Ⅱ型電熱恒溫培養箱 上海躍進醫療器械廠；HYG搖瓶柜 上海欣蕊自動化設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的培養及樣品的制備

1.2.1.1 發酵菌絲體的制備 將于液體培養基培養7d的蛹擬青霉液體種子以10%的接種量接種于裝有發酵培養基的500mL三角瓶中，裝液量為200mL，發酵培養溫度為25℃，搖床轉速200r/min，發酵5d后收集發酵醪液。對發酵醪液進行固液分離，濕菌絲體用蒸餾水反復沖洗3次，收集菌體，冷凍干燥后，粉碎過100目篩備用。

1.2.1.2 測定樣品的制備 精密稱取菌絲體干粉0.5g，采用實驗所得最優提取方法提取蟲草酸，過濾，用蒸餾水洗殘渣；將濾液、洗液合并于100mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度。再從中精密量取溶液1.0mL置于100mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度作為待測樣品。

1.2.2 分析檢測方法

1.2.2.1 蟲草酸提取方法的優化 通過料液中乙醇的濃度、料液比、微波提取功率、微波提取時間來確定單因素最佳條件。再根據單因素水平實驗結果，設計L9（34）正交實驗方案進行正交實驗以確定最優提取條件組合。正交實驗表見表1。

表1 正交實驗設計Table 1 Design of orthogonal test

1.2.2.2 標準曲線的制作 取濃度為10、20、30、40、50μg/mL標準品蟲草酸溶液各1mL，分置5個10mL試管中，分別加入1mL高錳酸鉀溶液混勻，室溫放置10min，加2mL 0.1%L-鼠李糖溶液以除去過多的高錳酸鹽，混勻后加4mL新鮮配制的nash試劑，53℃水浴加熱15min使其呈色，冷卻，用紫外分光光度計在412nm波長處，以蒸餾水（1mL）代替蟲草酸標準溶液，用同樣方法操作做為空白，分別測定其吸光度。以濃度c為橫坐標，吸光度A為縱坐標制得標準曲線[10]。1.2.2.3 樣品中蟲草酸含量的檢測 將20株蛹擬青霉菌株的發酵菌絲體配制成待測樣品，測定其吸光度，根據標準曲線方程計算蟲草酸含量。

2 結果與分析

2.1 D-甘露醇標準曲線

以濃度c為橫坐標，吸光度A為縱坐標制得D-甘露醇的標準曲線，如圖1所示。可以看出吸光度測定值與質量濃度之間有良好的線性關系，其回歸方程為：A=0.011c+0.0025，R=0.9998。將提取好的樣品測定其吸光度，根據標準曲線，計算蟲草酸的含量。

2.2 單因素最佳提取條件的確定

2.2.1 乙醇濃度的確定 固定其他三個因素不變（微波時間80s，微波功率300W，料液比（w/v）1∶60），只改變乙醇的濃度（0%、10%、30%、50%、70%、90%乙醇），如圖2所示。可以看出隨著料液比中乙醇的濃度的遞增，蟲草酸含量也隨著增加，而當料液比中乙醇的濃度為50%時，蟲草酸含量最大；當料液比中乙醇的濃度為70%、90%時，蟲草酸含量呈現下降趨勢，由此看出，當料液比中乙醇的濃度50%時，蟲草酸含量最大，所以最佳料液比中乙醇的濃度為50%，即單因素最佳。

圖1 甘露醇標準曲線Fig.1 Standard curve of D-mannitol

圖2 乙醇濃度對蟲草酸含量的影響Fig.2 Effect of ethyl alcohol concertration on cordycepic acid content

2.2.2 最佳料液比的確定 固定其他三個因素不變（微波時間80s，微波功率300W，乙醇濃度為50%），只改變料液比（w/v）（1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶120），如圖3所示，可以看出隨著提取溶液的增加，更有利于蟲草酸的溶出。當料液比增加到1∶80時，提取率最高。隨后隨著料液比的增加，蟲草酸的含量反而降低。故選擇最佳提取料液比為1∶80。

圖3 料液比對蟲草酸含量的影響Fig.3 Effect of material-liquid ratio on cordycepic acid content

2.2.3 最佳微波功率的確定 固定其他三個因素不變（微波時間80s，料液比（w/v）1∶80，乙醇濃度50%），只改變功率（100、150、200、250、300W），結果如圖4所示，可以看出隨著微波功率的增加，物質的加熱程度也隨著增加，有利于蟲草酸的提取。在微波功率達到200W時，蟲草酸含量最高。之后，蟲草酸含量開始減小。這可能是因為微波功率太大，產熱更快，使部分蟲草酸含量有所損失的原因。故選擇最佳微波提取功率為200W。

圖4 微波功率對蟲草酸含量的影響Fig.4 Effect of microwave power on cordycepic acid content

2.2.4 最佳微波提取時間的確定 固定其他三個因素不變（微波功率200W，料液比（w/v）1∶80，乙醇濃度50%），只改變提取時間（20、40、60、80、100、120s），結果如圖5所示。由圖看出，微波作用時間為20s時，蟲草酸不能充分的轉移到溶液中，隨著時間的增加，蟲草酸含量逐漸增加。在40s時達到一個小峰值，之后繼續增加時間，蟲草酸含量就繼續增幅，這就是微波的作用效果。在80s時達到最大，其后又下降，這是因為隨著微波時間的增加，溫度急劇升高，導致提取液部分揮發而使蟲草酸的含量有所損失，故以微波時間80s作為后續實驗依據。

圖5 微波時間對蟲草酸含量的影響Fig.5 Effect of microwave time on cordycepic acid content

2.3 正交實驗確定最優條件

正交實驗結果如表2所示。由表2可知，四因子作用的大小順序為乙醇濃度（D）gt;料液比（C）gt;微波功率（B）gt;微波時間（A），其最優方案為A1B2C3D3，即蛹擬青霉菌絲體以70%乙醇溶液為提取溶劑、料液比1∶100（w/v）、微波功率200W的條件下提取80s。但是由于最佳組合不在實驗設計中，需做驗證實驗。

按照正交實驗優選工藝A1B2C3D3和實驗設計中的最優組合A1B3C3D3，平行3次，進行驗證，A1B2C3D3工藝的蟲草素含量平均達58.298mg/g，而A1B3C3D3工藝才53.182mg/g。通過差異顯著分析，T＝3.586＞t0.05/2（4）= 2.776，表明在α＝0.05水平兩種提取工藝有顯著性差異，因此，最優提取工藝為A1B2C3D3。

2.4 不同菌株的蟲草酸含量

用優化得到的最佳提取條件即70%乙醇溶液為提取溶劑、料液比1∶100（w/v）、微波功率200W、提取時間80s提取蛹擬青霉液體發酵菌絲體中的蟲草酸，并測定含量。測定結果如表3所示。

表2 正交實驗結果Table 2 Results of orthogonal test

表3 不同菌株的蟲草酸含量Table 3 Cordycepic acid content of different strains

由表3的實驗結果可以看出，測定的20株菌株中22、25、28號菌株的發酵菌絲體中蟲草酸含量較大，22號菌株的蟲草酸含量最高，高達160.39mg/g。

2.5 樣品顯色后穩定性實驗

精密量取1mL濃度為0.05mg/mL（按原料計）的13號蛹擬青霉菌絲體提取液，使其呈色，每間隔20min測定其吸光度值，連續測定了3h，并計算蟲草酸含量，以考察其穩定性。結果如表4所示。根據表中數據，經過計算得出RSD為2.66%。

結果表明：隨著時間的推移，樣品在412nm處的蟲草酸含量變小，穩定性降低。待測樣品在前20min表現出比較穩定，40min之后比較有規律地等差降低，但是降低幅度很小，由此，可以認為樣品顯色后在180min之內表現較穩定[11]。

3 結論與討論

表4 呈色物質的穩定性Table 4 Stability of chromogenic reagent

本實驗通過大量實驗得出蛹擬青霉發酵菌絲體中蟲草酸含量的最佳提取方案，最佳提取條件為：乙醇濃度70%，料液比為1∶100，微波功率為200W，微波時間80s。比較分析原始蛹擬青霉菌株（13號菌株）及其低能離子束誘變菌株的液體發酵菌絲體中的蟲草酸含量后發現誘變菌株22、25、28號菌株的蟲草酸含量較高，其中22號菌株的含量最高，在以后的研究中可以作為參考。實驗過程中，菌株發酵菌絲體中蟲草酸含量測定方法利用比色法進行，該方法操作簡便、準確，精密度較好，可以作為蟲草類產品生產中蟲草酸檢測的一種通用方法。

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Extraction and determination of cordyceps acid in submerged fermentation mycelium of Cordyceps Militaris strains

SHAO Ying，LI Wen，WANG Tao
（Food Engineering Department，Xuzhou Insititute of Technology，Xuzhou 221008，China）

Cordyceps acid，that is，D-mannitol，is one of the main active ingredients in the type of fungus cordyceps.To explore Cordyceps militaris better，the extracting technology of cordyceps acid in several strains of Cordyceps militaris was determined.According to a large number of single-factor experiments and orthogonal design，the best extraction conditions were drawn：microwave time 80s，microwave power 200W，material-liquid ratio 1∶100，ethanol solvent concertration 70%.The strain with the highest acid content among 20 kinds of Cordyceps militaris strains was No.22 strain，whose cordyceps acid content was 160.39mg/g，which had value in production and application.

Cordyceps militaris；cordyceps acid；microwave assisted extraction

TS201.2

B

1002-0306（2012）01-0262-04

2011－01－07

邵穎（1979－），女，微生物學博士，講師，主要從事微生物資源的開發和應用研究。

徐州工程學院校級課題（XKY2007224和XKY2009122）。