響應面法優化酶法提取紅薯葉總黃酮的工藝

李佩艷，王 鋒，尹 飛，劉建學，戚艷艷，熊 瑞，裴亞鋒

（1.河南科技大學食品與生物工程學院，河南洛陽471003；2.河南科技大學農學院，河南洛陽471003）

響應面法優化酶法提取紅薯葉總黃酮的工藝

李佩艷1，王 鋒1，尹 飛2，劉建學1，戚艷艷1，熊 瑞1，裴亞鋒1

（1.河南科技大學食品與生物工程學院，河南洛陽471003；2.河南科技大學農學院，河南洛陽471003）

以紅薯葉為原料，優化紅薯葉總黃酮的酶法提取工藝。以酶用量、酶解時間和酶解溫度為三因素，以總黃酮的提取量為考察指標，進行中心組合實驗設計，并采用響應面法進行分析。實驗結果表明紅薯葉總黃酮的最佳工藝條件為：酶用量為0.65%，酶解時間88min，酶解溫度為51℃，在此條件下，紅薯葉總黃酮的提取量最高，可達176.15mg/g。

紅薯葉，總黃酮，酶法提取，響應面法

我國是世界上最大的紅薯生產國，產量占世界總產量的80%[1]。紅薯莖葉是紅薯作物生產中的主要副產品，產量也是相當可觀，年產量可達1億t以上[2]，但紅薯葉在我國的利用率非常低，通常作為畜禽飼料或被廢棄田間，利用率不到10%，造成極大的資源浪費。黃酮類化合物是一種良好的活性自由基清除劑，具有調整免疫和內分泌的作用，還具有抗癌、抗腫瘤、抗心腦血管疾病等作用，是新興功能食品中發揮作用的生物活性因子[3]。紅薯葉中含有豐富的黃酮，而且紅薯葉來源廣、價格低，若對紅薯葉中總黃酮采取有效的收集和提取，將會變廢為寶，提高產薯區經濟效益，增加農民收入，因此紅薯葉中的總黃酮研究越來越受到人們的關注。已有學者對紅薯葉中黃酮進行了提取、鑒定[4-6]。但報道的紅薯葉黃酮的提取方法大都采用溶劑提取法，幾乎沒有采用酶法提取的報道。因此，本文以紅薯葉為原料，采用纖維素酶輔助處理，提取紅薯葉中總黃酮，為紅薯葉的綜合利用和加工開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅薯葉 河南科技大學農場提供；蘆丁標準品 購于中國藥品與生物制品檢定所；纖維素酶 購于和氏璧生物技術有限公司；乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、冰醋酸 均為分析純。

101-2-BS型電熱鼓風干燥箱 上海市躍進醫療器械廠；722N型分光光度計 上海市精科儀器廠；JJ600型電子天平 常熟雙杰測試儀器廠；HH-S型恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市億通電子有限公司；BS200S型電子分析天平 北京賽多利斯天平有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅薯葉中總黃酮的提取 紅薯葉經80℃烘箱干燥，之后粉碎、篩分得到紅薯葉粉。準確稱取一定量的紅薯葉粉末，加入乙醇，再加入一定量的酶進行

酶解，酶解后過濾，濾液備用。

1.2.2 黃酮的測定 吸取樣品液0.5mL，置10mL容量瓶，分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，靜置6min；再加10%硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻，靜置6min；再加4%氫氧化鈉溶液4.0mL，用乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置12min，以試劑作空白，于510nm處測吸光度。根據回歸方程，計算樣品中總黃酮的提取量。

總黃酮提取量（mg/g）=提取的總黃酮質量（mg）/紅薯葉的質量（g）

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線的確定

以蘆丁為對照品，建立的蘆丁標準曲線如圖1所示。擬合的直線方程為：Y＝0.0033x-0.0173，R2＝0.9958。

圖1 總黃酮物質的標準曲線Fig.1 The standard curve of flavanoids

2.2 單因素實驗結果與分析

分別考察酶用量、酶解時間和酶解溫度3個影響因素對紅薯葉總黃酮提取量的影響。

2.2.1 酶用量對總黃酮提取量的影響 設定酶用量分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，在酶解時間90min、酶解溫度50℃的條件下提取紅薯葉總黃酮，結果見圖2。由圖2可看出，紅薯葉中總黃酮的提取量隨酶用量的增加而大幅上升，酶用量達0.6%后，提取量隨酶用量增大變化不明顯。這是因為酶量低于最佳值時，酶解未進行完全；隨著酶用量增加，酶促反應速度提高，總黃酮提取量大幅上升；酶用量超過一定值時，酶解進行較完全，當酶濃度較高時，反應速度并不隨酶濃度增加而增大，酶濃度對反應速度的影響具有飽和現象。綜合考慮選用0.6%為最佳酶用量。

圖2 不同酶用量對總黃酮提取量的影響Fig.2 The effect of different enzyme amount on the extraction of flavanoids

2.2.2 酶解時間對總黃酮提取量的影響 設定酶解時間分別為30、60、90、120、150min，在酶用量為0.6%、酶解溫度50℃條件下提取紅薯葉總黃酮，結果見圖3。由圖3可看出，30～90min內總黃酮提取量隨著酶解時間的增加而增大。這是因為隨酶解時間延長，酶解反應進行得較完全，紅薯葉中黃酮成分不斷地溶出、進入溶液而導致的。提取時間為90min時，紅薯葉中總黃酮的提取量最大，達到168mg/g，之后，隨酶解時間的增加，總黃酮提取量反而下降。因此，選擇90min為最佳的酶解時間。

圖3 不同酶解時間對總黃酮提取量的影響Fig.3 The effect of different enzymolysis time on the extraction of flavanoids

2.2.3 酶解溫度對總黃酮提取量的影響 設定酶解溫度分別為30、40、50、60、70℃，在酶用量0.6%、酶解時間90min的條件下提取紅薯葉總黃酮，結果見圖4。由圖4可看出：酶解溫度在30～60℃時，紅薯葉總黃酮的提取量隨酶解溫度的升高而增大，60℃時紅薯葉中總黃酮的提取量達到最大值，為174mg/g，以后隨酶解溫度的提高總黃酮的提取量減小。這是因為溫度對酶解反應速度的影響有兩種效應：一種當溫度升高，酶活性增強、反應速度加快；另一種溫度繼續升高，酶活性減弱、酶的穩定性降低；低于60℃時以前種效應為主，高于60℃時以后種效應為主。因此，選擇60℃為最佳酶解溫度。

圖4 不同酶解溫度對總黃酮提取量的影響Fig.4 The effect of different enzymolysis temperature on the extraction of flavanoids

2.3 實驗設計結果與響應面分析

2.3.1 回歸模型的建立及其顯著性檢驗 根據Box-Benhnken中心組合實驗設計原理，綜合單因素影響實驗結果，選取酶用量、酶解時間和酶解溫度為三個因素，采用三因素三水平的響應面分析方法進行分析。酶用量、酶解時間和酶解溫度分別記為X1，X2，X3，并以+1，0，-1分別代表自變量的高、中、低三個水平，按方程xi=（Xi-X0）/X對自變量進行編碼，其中xi為自變量編碼值，Xi為自變量真實值，X0為實驗中心點處自變量真實值，X為自變量的變化步長，各因素的編碼值和真實值見表1。

表1 響應面分析因素與水平Table 1 Analytical factors and levels for RSA

實驗設計結果見表2。應用Design Expert軟件進行多元回歸擬合分析，可以得到紅薯葉總黃酮的提取量與各因素變量的二次方程模型：

Y=174.68+2.58X1+0.73X2-0.39X3-2.08X1X2+ 1.94X1X3+0.02X2X3-2.84X12-2.03X22-3.05X32

表2 響應面分析方案及實驗結果Table 2 Arrangement and experimental results of response surface central composite design

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance for the flavanoids extraction yield with various extraction conditions

對表2中的實驗結果進行統計分析，得到的方差分析結果如表3所示。由表3可知，酶用量的一次項達到顯著水平，而酶解時間、酶解溫度的一次項均為不顯著水平，因素X1、X1X2、X1X3、X12、X22、X32在該模型中為顯著指標，這說明酶用量是影響紅薯葉總黃酮提取的主要因素，各實驗因子對響應值的影響不是簡單的線性關系，存在著交互作用。由F值可知，各因素對紅薯葉總黃酮提取量影響的次序為：酶用量gt;酶解時間gt;酶解溫度。

從表3可以看出，用上述回歸方程描述各因素與響應值的關系時，其因變量和全體自變量之間的線性關系顯著（r2＝438.9027/477.0281=0.9201），當P值小于0.05時表示該指標顯著，回歸方差分析結果表明，整體模型的P值為0.0002，小于0.05，表明該二次方程模型達到顯著水平，該模型回歸顯著，并且失擬項的值為0.1145，大于0.05，失擬項不顯著，說明該方程對實驗擬合較好，該實驗方法是可靠的。

2.3.2 響應面分析 響應面圖是響應值對各實驗因素所構成的三維空間曲線圖，曲面越陡峭，則表明該因素對實驗結果的影響越大，相應表現為響應值變化的大小。等高線圖的形狀則可以反映出各因素效應強弱的大小，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。考察擬合響應曲面的形狀，分析酶用量、酶解時間、酶解溫度對紅薯葉總黃酮提取量的影響，結果見圖5～圖7。由圖可知，酶用量對紅薯葉總黃酮提取量的影響最為顯著，而酶解時間、酶解溫度對紅薯葉總黃酮提取量的影響不顯著。響應面分析可得出酶用量與酶解時間、酶用量與酶解溫度之間交互作用顯著，而且表3中X1X2、X1X3的P值均小于0.05，這均說明了X1X2、X1X3之間存在著交互作用。

圖5 酶用量和酶解時間對紅薯葉總黃酮提取量的影響Fig.5 The effect of enzyme amount and enzymolysis time on the extraction of flavanoids

圖6 酶用量和酶解溫度對紅薯葉總黃酮提取量的影響Fig.6 The effect of enzyme amount and enzymolysis temperature on the extraction of flavanoids

圖7 酶解時間和酶解溫度對紅薯葉總黃酮提取量的影響Fig.7 The effect of enzymolysis time and enzymolysis temperature on the extraction of flavanoids

2.3.3 提取工藝條件的確定 用Design Expert軟件進行最佳理論工藝條件優化，結果如下：酶用量為0.65%，酶解時間87.84min，酶解溫度為51.01℃，在此最佳工藝條件下紅薯葉總黃酮的提取量為175.294mg/g。為檢驗響應曲面法所得結果的可靠性，采用上述優化提取條件下提取紅薯葉總黃酮，考慮到實際操作的便利，將提取工藝參數修正為：酶用量為0.65%，酶解時間88min，酶解溫度為51℃，實際測得的平均提取率176.15mg/g，與理論預測值相比，其相對誤差約為0.004%。因此，基于響應曲面法所得的優化提取工藝參數準確可靠，具有實用價值。

3 結論

采用中心組合實驗設計和響應面分析法，能可靠地進行紅薯葉總黃酮提取工藝優化實驗以及數據分析。在單因素實驗基礎上，通過中心組合實驗，設計三因素三水平響應面分析法實驗，可得到二次數學模型方程，確定出紅薯葉總黃酮提取的最佳工藝參數：酶用量為0.65%，酶解時間88min，酶解溫度51℃。按照此工藝提取總黃酮的提取率較高，本實驗研究為酶法提取紅薯葉中總黃酮提供了理論依據。

[1]蔡健，王薇.新型紅薯葉食品加工技術[J].食品研究與開發，2003，24（6）：64.

[2]胡立明，高蔭榆，陳才水.甘薯葉研究進展[J].鄭州工程學院學報，2002，23（1）：79-84.

[3]孫興勤.保健蔬菜-甘薯葉[J].云南農業科技，1994（2）：46-47.

[4]向仁德，丁健辛，韓英.引種的巴西甘薯葉化學成分研究[J].中草藥，1994，25（4）：179-181.

[5]鄒耀洪.國產甘薯葉黃酮類成分研究[J].分析測試學報，1996，15（1）：71-74.

[6]劉法錦，金幼蘭，彭源貴.番薯藤化學成分的研究[J].中國中藥，1991，16（9）：551-552.

Optimization of enzyme-assisted extraction of flavanoids from sweet potato leaves by response surface analysis

LI Pei-yan1，WANG Feng1，YIN Fei2，LIU Jian-xue1，QI Yan-yan1，XIONG Rui1，PEI Ya-feng1
（1.College of Food and Bioengineering，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China；2.College of Agronomy，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China）

Enzyme extraction was applied to the extraction of flavanoids.The extraction technique was optimized using response surface methodology.Effects of enzyme amount，enzymolysis time and enzymolysis temperature on extraction yield of flavanoids were investigated.Response surface central composition design was applied to optimize these factors by considered the interactions between the variables.A quadratic polynomial regression model was developed.The optimal enzyme extraction conditions were as follows：enzyme amount 0.65%，enzymolysis time 88min and enzymolysis temperature 51℃.Under these conditions，the flavanoids from sweet potato leaves could reach to 176.15mg/g.

sweet potato leaves；flavanoids；enzyme extraction；response surface method

TS201.1

B

1002-0306（2012）01-0275-04

2010－10－11

李佩艷（1977-），女，碩士，講師，主要從事食品質量與安全方面的教學與研究。

河南科技大學大學生研究訓練計劃（SRTP）項目（2011118）；河南科技大學人才科學研究基金。