東北野生山榛子樹(shù)皮、樹(shù)葉、果皮中紫杉醇的超聲輔助提取方法研究

陶冬冰，孟憲軍，劉 彬

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110086）

東北野生山榛子樹(shù)皮、樹(shù)葉、果皮中紫杉醇的超聲輔助提取方法研究

陶冬冰，孟憲軍，劉 彬

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110086）

采用超聲提取法對(duì)東北野生山榛子樹(shù)的果皮、樹(shù)皮、樹(shù)葉進(jìn)行了紫杉醇的提取，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)得出了最佳的超聲輔助提取條件：乙醇濃度80%，超聲頻率300Hz，提取溫度50℃，料液比1∶3，提取時(shí)間60min，三種樣品（樹(shù)皮、果皮、樹(shù)葉）中紫杉醇的得率均為最大值。果皮中的提取率為0.0059%，樹(shù)皮中的提取率為0.0048%，樹(shù)葉中的提取率為0.0033%，最終確定果皮中紫杉醇的含量gt;樹(shù)皮中紫杉醇的含量gt;樹(shù)葉中的紫杉醇的含量。

榛子，紫杉醇，超聲提取

榛子，屬樺木科榛屬植物，又稱(chēng)山板栗、尖栗、棰子等[1]。在世界范圍內(nèi)榛屬有約20個(gè)品種，主要分布于亞洲、歐洲及北美洲；在中國(guó)境內(nèi)共有8個(gè)種類(lèi)及2個(gè)變種，分布于東北、華東、華北、西北及西南地區(qū)[2]。榛子里包含著抗癌化學(xué)成分紫杉酚[3]，可以治療卵巢癌和乳腺癌以及其他一些癌癥，可延長(zhǎng)病人的生命期[4]。目前，紫杉醇的來(lái)源主要有：天然紅豆杉植物提取、人工種植、化學(xué)半合成、化學(xué)全合成、生物合成、真菌發(fā)酵、植物組織細(xì)胞培養(yǎng)、基因工程[5]。迄今為止，紫杉醇的主要來(lái)源仍是從天然紅豆杉屬植物的莖皮中提取[6]。但是，由于紅豆杉生長(zhǎng)緩慢，又極少成林，資源十分有限，要獲得1kg紫杉醇，需要104kg樹(shù)皮，約4000棵紅豆杉樹(shù)[7]。本文采用東北野生山榛子的樹(shù)皮及果皮進(jìn)行紫杉醇的提取，可以大大緩解紫杉醇提取原料的資源短缺問(wèn)題，并對(duì)東北野生山榛子的綜合開(kāi)發(fā)利用有一定的借鑒作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

野生山榛子樹(shù) 均采自于鐵嶺地區(qū)，分別取樹(shù)皮、樹(shù)葉和果皮自然風(fēng)干后粉碎，得到實(shí)驗(yàn)樣品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的預(yù)處理 取材為野生山榛子樹(shù)，分別取樹(shù)皮、樹(shù)葉及果皮，自然風(fēng)干后，通過(guò)粉碎機(jī)粉碎，然后過(guò)60目篩備用[8]。

1.2.2 超聲提取方法 分別稱(chēng)取果皮、樹(shù)皮、枝葉預(yù)處理樣品100g，加80%乙醇的水溶液100mL[9]。選擇超聲的時(shí)間、超聲波的頻率、料液比、提取溫度4個(gè)因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[10]，考察這四個(gè)因素對(duì)紫杉醇超聲提取率的影響。將各因素取3水平，進(jìn)行4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)。超聲提取結(jié)束后，過(guò)濾，濾液40℃時(shí)減壓蒸去乙醇，得水溶液[11]。然后定容至100mL，準(zhǔn)確吸取5mL處理后的提取液，測(cè)定其吸光度值[12]。考察超聲波頻率、提取溫度、料液比、提取時(shí)間對(duì)提取結(jié)果的影響。

1.2.3 紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 顯色劑選用茴香醛-硫酸-乙醇（1∶3∶50，V/V），精確稱(chēng)取紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品0.01g溶于50mL乙醇，使用可見(jiàn)-紫外分光光度計(jì)在190～300nm掃描以確定最大紫外吸收峰[13]。將上述溶液稀釋為0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008mg/L，在233nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，以乙醇為對(duì)照，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，紫外掃描圖譜顯示紫杉醇的最大吸收波長(zhǎng)為233nm。得到回歸方程：y=0.023x+0.067，R2=0.9977。

圖1 紫杉醇測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of taxol detection

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

由于紫杉醇是一種復(fù)雜的二萜類(lèi)化合物，難溶于水，不溶于石油醚，可溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷等有機(jī)溶劑，結(jié)合紫杉醇的溶解特性，本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)考察了三種試劑：甲醇、乙醇、丙酮，試劑濃度為80%，超聲頻率300Hz，超聲時(shí)間60min，料液比1∶3，溫度50℃進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)。

表1 不同提取溶劑對(duì)紫杉醇提取率的影響Table 1 Extraction rate of taxol with different extracting solvent

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：丙酮提取液＞乙醇、甲醇提取液提取率，但是從食品級(jí)考慮其他溶劑均具有毒性，故選擇乙醇為提取溶劑。

2.2 超聲提取過(guò)程中不同因素對(duì)提取率的影響

圖2 超聲頻率對(duì)提取率的影響Fig.2 Ultrasonic frequency on extraction rate

2.2.1 超聲頻率對(duì)提取率的影響 在乙醇濃度為80%，溫度為50℃，提取時(shí)間60min，料液比l∶3的條件下，考察超聲波頻率對(duì)提取率的影響。由圖2可見(jiàn)，隨著超聲波功率的增加，三種樣品（果皮、樹(shù)皮、樹(shù)葉）吸光度逐漸增大，提取率逐漸增大，但是超聲波頻率大于250Hz后，吸光度值增加很少，提取率增量也隨之減小，同時(shí)考慮到經(jīng)濟(jì)性和超聲波頻率過(guò)高可能使原材料降低活性，所以選擇超聲波頻率范圍為200、250、300Hz。

2.2.2 溫度對(duì)提取率的影響 在超聲波頻率為300Hz，乙醇濃度80%，提取時(shí)間60min，料液比1∶3的條件下，考察提取溫度對(duì)紫杉醇提取的影響，結(jié)果表明（圖3），隨著溫度升高，三種樣品（果皮、樹(shù)皮、樹(shù)葉）吸光度值逐漸增加。但溫度過(guò)高（gt;40℃），吸光度值逐漸下降，提取率也緩慢下降，并在逐漸升溫后持續(xù)下降，所以選擇溫度范圍為30、40、50℃。

圖3 溫度對(duì)提取率的影響Fig.3 Temperature on extraction rate

2.2.3 料液比對(duì)提取率的影響 在超聲波頻率為300Hz，乙醇濃度為80%，提取溫度50℃，提取時(shí)間60min的條件下，考察料液比對(duì)紫杉醇提取率的影響。

圖4 料液比對(duì)提取率的影響Fig.4 Ratio of material to liquid on extraction rate

圖4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)料液比≤1∶3時(shí)，三種樣品（果皮、樹(shù)皮、樹(shù)葉）吸光度值反而下降，這有可能是因?yàn)槿軇w積的增多使除紫杉醇以外的其他雜質(zhì)溶出，從而抑制紫杉醇的溶出。所以選擇料液比范圍為1∶2、1∶3、1∶4。

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響 在料液比（g/mL）為1∶3，乙醇濃度80%，超聲波頻率為300Hz，溫度為50℃的條件下，考察提取時(shí)間對(duì)紫杉醇提取的影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖5）表明，超聲波提取時(shí)間為60min時(shí)，提取效果最好。當(dāng)時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)，三種樣品（果皮、樹(shù)皮、樹(shù)葉）吸光度反而下降，這可能是由于超聲波的機(jī)械剪切作用，長(zhǎng)時(shí)間加熱使大分子斷裂，在后處理中損失。從而使吸光度值降低，最后導(dǎo)致提取率的降低，所以選擇提取時(shí)間范圍為50、60、70min。

圖5 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.5 Extracting time on extraction rate

2.3 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)以上單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定因素水平范圍如下：超聲頻率（A）分別為200、250、300Hz；料液比（B）分別為：1∶2、1∶3、1∶4；溫度（C）分別為：30、40、50℃；提取時(shí)間（D）分別為50、60、70min。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments

因三種原料得率具有一定規(guī)律，故只選取得率較高的果皮進(jìn)行四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如表3。

表3 正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments

從正交實(shí)驗(yàn)可以看出：超聲頻率（A）對(duì)得率的影響最大，其次是料液比（B），之后是提取時(shí)間（D），最后是提取的溫度（C）。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)得到的最佳工藝條件為：即頻率300Hz，料液比1∶3，超聲提取溫度為50℃，超聲提取時(shí)間為60min。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別對(duì)果皮、樹(shù)皮、樹(shù)葉三種原料進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，采用優(yōu)化后的條件：即乙醇濃度80%，頻率300Hz，料液比1∶3，超聲提取溫度為50℃，超聲提取時(shí)間為60min。進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，取平均數(shù)得到果皮中的紫杉醇提取率為0.0059%，樹(shù)皮中的提取率為0.0048%，樹(shù)葉中的提取率為0.0033%。

3 結(jié)論

本文通過(guò)超聲提取法提取了東北地區(qū)野生山榛子果皮、樹(shù)皮、樹(shù)枝中的紫杉醇含量，通過(guò)實(shí)驗(yàn)選擇最佳條件為：乙醇濃度為80%，超聲頻率300Hz，料液比為1∶3，溫度為50℃，提取時(shí)間為60min。其中超聲頻率對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響最為顯著，提取的溫度相對(duì)影響比較小。

最后通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合分析得出，果皮中紫杉醇的含量（0.0059%）高于樹(shù)皮中紫杉醇的含量（0.0048%）高于樹(shù)葉中紫杉醇的含量（0.0033%）。

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Study on ultrasonic extraction technology of taxol from leaves，bark，fruit peels of northeast wild hazel

TAO Dong-bing，MENG Xian-jun，LIU Bin
（Shenyang Agriculture University，Shenyang 110086，China）

This thesis adopts ultrasonic extraction method to extract the taxol from fruit peels，tree bark and tree leaves of the northeast wild hazel trees.According to single factor experiment and orthogonal experiment，the optimum ultrasound-associated extraction conditions were showed as follows：concentration of ethanol was 80%，ultrasonic frequency was 300Hz，extraction temperature was 50℃，RMV（ratio of material to liquid）was 1∶3 and extracting time was 1h.The taxol’s yield rates of three kinds of samples（tree bark，fruit peel，tree leaves）were all the maxima.The extraction rate of fruit peel was 0.0059%，the extraction rate of tree bark was 0.0048% and the extraction rate of tree leaves was 0.0033%.At last，it comes to the conclusion that the taxol content of fruit feel＞the taxol content of tree bark＞the taxol content of tree leaves.

hazelnut；taxol；ultrasonic extraction

TS255.1

B

1002-0306（2012）01-0299-03

2010－12－06

陶冬冰（1983-），男，碩士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事植物中生理活性物質(zhì)提取及功能性研究。