響應面分析法優化菊芋渣中蛋白的提取工藝

張 維，李雪雁，張秀蘭，胡志明，李 冰

（蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730050）

響應面分析法優化菊芋渣中蛋白的提取工藝

張 維，李雪雁*，張秀蘭，胡志明，李 冰

（蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730050）

以菊芋渣為研究對象，用蛋白質提取率作為衡量提取工藝的指標。在單因素實驗基礎上，選取pH、提取溫度、提取時間為自變量，蛋白提取率為響應值，利用Box-Benhnken中心組合設計原理和響應面分析法，研究各自變量及其交互作用對提取率的影響，模擬得到二次多項式回歸方程的預測模型，在固液比為1∶30（g/mL）的條件下，確定最佳提取條件為pH14.0、提取溫度82℃、提取時間2h。在此條件下，平均蛋白提取率為22.7747mg/g。與理論預測值23.3187mg/g相比，其相對誤差約為2.33%。說明通過響應面優化后得出的回歸方程具有一定的實踐指導意義。

菊芋渣，蛋白，提取，響應面分析法

菊芋（俗稱洋姜）是多年生菊科植物，我國南北各地均有種植。它除了含菊糖外，還含有一定數量的蛋白質、果膠、纖維素及其他成分。目前對菊芋的研究主要集中在以下幾個方面：菊芋中菊粉的提取，純化和功能；菊芋葉中活性成分的研究；菊芋治理沙漠的研究；微生物產菊粉酶的研究等。而菊芋加工后的副產品菊芋渣中粗蛋白含量達9.6%[1]（相對干基），粗脂肪含量1.6%，是各種畜禽的良好飼料。1t菊芋塊莖加工后可得菊芋渣650kg[1]（水分含量約為83%），如若長期堆棄，不僅污染環境，而且會造成資源的浪費。本實驗著重對菊芋渣蛋白質的提取工藝進行了研究，得到了菊芋渣蛋白質的最佳提取條件，為今后菊芋蛋白質的大規模生產和其產品的深加工提供了可行性依據，對菊芋的綜合利用及新產品的開發提供基礎研究資料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菊芋渣 白銀熙瑞生物工程有限公司提供；鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇、磷酸 均為分析純；考馬斯亮藍G-250 上海綠鳥科技發展公司；所用其他試劑均為分析純。

TGL-16C高速臺式離心機 上海安亨科學儀器廠；722s可見光分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；HHS電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；ALC-110.4電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；85-2磁力攪拌器 上海浦東物理光學儀器廠；PHS-3C pH計 上海偉業儀器廠；FD-1型冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器。

1.2 實驗方法

1.2.1 分離蛋白的提取工藝流程 菊芋渣→干燥（自然風干）→粉碎（60目）→攪拌浸提→離心（3000r/min）→取上清液→調pH至等電點→離心 （4000r/min）→取沉淀→調pH至7.0→透析脫鹽→真空凍干→粗蛋白粉

1.2.2 提取工藝最優參數的確定 在單因素實驗時，用菊芋渣與菊芋干粉的蛋白提取率作對照，依次改變菊芋渣堿提液的pH、溫度和堿提時間，以菊芋渣蛋白得率作為評價指標進行研究和分析，并確定三因素三水平的最佳參數進行響應面分析[2-4]。實驗設計中的水平及編碼表見表1。

表1 響應面實驗因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.2.3 蛋白提取率的測定 蛋白提取率（mg/g）=提取液中蛋白質總蛋白質量（mg）/原料的總質量（g）

提取液中蛋白質含量測定：采用考馬斯亮藍法[5]。取0.1mL提取液，加入考馬斯亮藍染液5mL，混勻，靜置3min，在波長595nm處測吸光度；依蛋白標準曲線的回歸方程y=0.3761x-0.0085（R2=0.9961）計算可溶性蛋白的含量。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 堿液pH對菊芋蛋白提取率的影響 堿液浸提菊芋渣過程中控制體系的溫度80℃、料液比1∶30（g/mL）、浸提時間60min，設置不同pH的堿液。堿液pH對菊芋渣蛋白提取的影響結果見圖1。蛋白質溶解度隨pH升高而增大，蛋白質溶出增多。從圖1可知，隨著堿液pH增加，蛋白提取率呈增加的趨勢，其中pH為13.5時蛋白提取率最高，而后蛋白含量趨于穩定。而菊芋干粉在pH為13時，蛋白提取率達到最高，可見菊芋的加工過程使其中蛋白的堿耐受性增加。綜合考慮兩評價指標的最佳pH，選取pH13、13.5、14繼續對菊芋渣蛋白的提取做響應面分析以確定最佳的堿液pH。

圖1 pH對菊芋蛋白提取率的影響Fig.1 Influence of pH value on Jerusalem artichoke protein extraction rate

2.1.2 浸提溫度對菊芋蛋白提取率的影響 用堿液浸提菊芋蛋白過程中控制體系pH13.5、浸提時間60min、料液比1∶30（g/mL），設置不同的溫度，研究浸提溫度對菊芋渣蛋白提取率的影響見圖2。從圖2可知，隨著溫度的升高，蛋白提取率逐漸提高，80℃以上蛋白提取率趨于不變；蛋白提取率隨溫度升高，先升高再趨于穩定，80℃時蛋白提取率最高。而且菊芋干粉的蛋白提取率也在80℃時趨于穩定。綜合考慮兩評價指標確定溫度為70、80、90℃繼續對菊芋渣蛋白的提取做響應面分析以確定最佳的浸提溫度。

圖2 提取溫度對菊芋蛋白提取率的影響Fig.2 Influence of extracting temperature on Jerusalem artichoke protein extraction rate

2.1.3 浸提時間對菊芋蛋白提取率的影響 堿液浸提菊芋蛋白過程中控制體系的溫度80℃、料液比1∶30（g/mL）、堿液pH13.5，設置不同的浸提時間，研究浸提時間對菊芋渣蛋白制備的影響，結果見圖3。如圖3所示，蛋白提取率隨著時間的增加而增加，2h以后提取率開始下降，而蛋白提取率隨時間增加先提高再下降。這個過程可能是浸提時間延長，蛋白的溶出增加，一定時間后，蛋白的溶出達到飽和，則溶出率趨于平衡，若再進一步延長浸提時間，可能因為微生物生長等因素使蛋白質變性從而使提取率降低。而菊芋干粉中蛋白的溶出則在1h時達到飽和。綜合評價兩指標的最佳浸提時間段，選取1、2、3h繼續做響應面分析以確定最佳的浸提時間。

圖3 提取時間對菊芋蛋白提取率的影響Fig.3 Influence of extracting time on Jerusalem artichoke protein extraction rate

2.1.4 料液比對菊芋蛋白提取率的影響 堿液浸提菊芋渣蛋白過程中控制體系的溫度80℃、浸提時間2h、堿液pH13.5，設置不同的料液比，研究料液比對菊芋渣蛋白制備的影響，結果見圖4。如圖4所示，菊芋干粉蛋白提取率隨堿液量的增加變化不大，而菊芋渣蛋白提取率則隨堿液量增加而提高。從圖4可以看出，在料液比1∶30（g/mL）左右，蛋白溶解較為充分。

圖4 固液比對菊芋蛋白提取率的影響Fig.4 Influence of solid-liquid ratio on Jerusalem artichoke protein extraction rate

2.2 響應面法提取條件的優化

2.2.1 響應面實驗設計及結果 根據Box-Behnken[6]中心組合實驗設計原理，綜合分析單因素實驗，確定提取料液比為1∶30，選取對菊芋渣蛋白提取影響顯著的3個因素（pH、提取溫度、提取時間），設計了3因素3水平的響應面分析實驗。

表2 Box-Behnken實驗設計及結果Table 2 Results of response surface experiments

使用Design Expert7.0軟件，以pH、提取溫度、提取時間為響應變量，以菊芋渣蛋白提取率為響應值（指標值）對表3的數據進行處理，得到表3回歸方程方差分析表，利用軟件進行非線性回歸的二次多項式擬合，得到預測模型如下：Y=18.63+5.38A+0.80B+ 0.44C+0.68AB+0.55AC-0.26BC-0.88A2-0.44B2-4.25C2

表3為回歸分析結果，回歸方差分析顯著性檢驗表明，該模型回歸顯著（p＜0.0001），失擬項不顯著，并且該模型R2=0.9953，R2Adj=0.9893，說明該模型與實際實驗擬合較好，自變量與響應值之間線性關系顯著，可以用于菊芋渣蛋白提取工藝實驗的預測。

方差分析結果還表明，方程的一次項中A、B對響應值的影響顯著，二次項A（pH）、B（提取溫度）、C（浸提時間）對響應值的影響顯著。由此可見，各具體實驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系。

各因素的影響程度分析，各因素的F值可以反映出各因素對實驗指標的重要性，F值越大，表明對實驗指標的影響越大，即重要性越大。從方差分析表可知：FA=615.09，FB=13.50，FC=4.19，即各因素對堿溶性蛋白提取率的影響程度大小順序為：pH＞提取溫度＞提取時間。

根據回歸方程，做出響應面分析圖（圖5～圖7），考察所擬合的響應曲面的形狀，分析pH、提取溫度、提取時間對菊芋渣蛋白提取率的影響。

2.2.2 各因素之間的交互作用 見圖5～圖7。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis results of regression and variance

圖5 pH和提取溫度對蛋白提取率影響的響應面圖Fig.5 Response surface of pH and extraction temperature on the extraction rate of protein

圖6 提取時間和pH對蛋白提取率影響的響應面圖Fig.6 Response surface of pH and extraction time on the extraction rate of protein

2.2.3 提取工藝條件的驗證 為進一步確定最佳點，在模型濃度范圍內選擇出發點，使用快速上升法進行優化得到的菊芋蛋白提取的最佳方案為：pH14.00，提取溫度81.79℃，提取時間：2.11h，菊芋渣蛋白得率23.3187mg/g。為檢驗響應曲面法所得結果的可靠性采用上述優化提取條件提取南瓜多糖，考慮到實際操作的便利，將提取工藝參數修正為pH14.0，提取溫度82℃，提取時間2h。以上述條件進行實驗結果的驗證，重復3次實際測得的蛋白得率分別為22.6252、23.1173、22.5890mg/g，平均蛋白得率為22.7747mg/g。與理論預測值相比，其相對誤差約為2.33%。說明通過響應面優化后得出的回歸方程具有一定的實踐指導意義。

圖7 提取時間和提取溫度對蛋白提取率影響的響應面圖Fig.7 Response surface of extraction time and extraction temperature on the extraction rate of protein

3 結論

采用堿提的方法對菊芋渣中蛋白質進行提取，通過單因素實驗和Box-Behnken中心組合設計原理以及響應面分析法對提取工藝進行優化，擬合了pH、提取溫度、提取時間這3個因素對蛋白的原料提取率的回歸模型，經檢驗證明該模型合理可靠，能較好地預測菊芋渣中堿溶性蛋白的原料提取率。由該模型確定的最優工藝條件為pH14.0，提取溫度82℃，提取時間2h。在此條件下，得到菊芋渣平均蛋白得率為22.7747mg/g。通過模型系數顯著性檢驗，得到因素的主效應關系為：pH＞提取溫度＞提取時間。

同時，在單因素實驗時與菊芋干粉做了對照實驗。結果表明雖然菊芋干粉中堿溶性蛋白的提取率比菊芋渣的高，但從資源充分利用的角度來看，菊芋渣還是具有很大的開發潛力。目前，國內外對菊芋渣的研究未見報道，因此，為了充分開發利用菊芋渣蛋白這一植物蛋白資源，仍需加大科研力度，完善菊芋蛋白提取分離基本理論和方法，滿足工業產業化生產的要求。

[1]秦亞兵，徐長警，王華，等.寧夏興建菊芋系列產品加工業的構想與建議[J].寧夏農林科技，2004（1）：31-35.

[2]矯麗媛，呂敬軍，陸豐升，等.花生分離蛋白提取工藝優化研究[J].食品科學，2010，20（31）：196-201.

[3]李明妹，姚開，賈冬英.堿提酸沉法制備花生分離蛋白的優化條件[J].中國油脂，2004，29（11）：21-23.

[4]陳學玲，羅金國，何建軍，等.大豆11S球蛋白提取分離方法研究[J].中國糧油學報，2007，22（1）：160-163.

[5]趙英永，戴云，崔秀明，等.考馬斯亮藍G-250染色法測定草烏中可溶性蛋白質含量[J].云南民族大學學報：自然科學版，2006，15（3）：235-237.

[6]BOXG E P，BEHNKEN D W.Some new three level designs for the study of quantitative variables[J].Technometrics，1960（2）：455-475.

Optimization of extraction conditions of protein from Jerusalem artichoke residue by response surface methodology

ZHANG Wei，LI Xue-yan*，ZHANG Xiu-lan，HU Zhi-ming，LI Bing
（School of Life Science and Engineering，Lanzhou University of Science and Technology，Lanzhou 730050，China）

Jerusalem artichoke residue as the research object，with the protein extraction rate as a measure indicator.Three extraction parameters including pH，extraction temperature and extraction time were optimized using central composite design and response surface methodology based on single factor investigations for achieving maximum the protein extraction rate.The interaction of the respective variables and their influence on the extraction rate were studied by using Box-Benhnken central composite design and response surface analysis theory，the simulated quadratic polynomial regression equation of prediction model was set up.Under the condition of solid-liquid ratio1∶30（g/mL），the optimum extraction condition for pH14，extraction temperature 82℃，extraction time of 2h.Under these conditions，the average protein yield ratio was 22.7747mg/g，compared to the theoretical value，the relative error of 2.33%.Optimized by response surface regression equation derived some practical significance.

Jerusalem artichoke residue；protein；extraction；response surface analysis

TS255.1

B

1002-0306（2012）01-0305-04

2011－01－17 *通訊聯系人

張維（1986-），男，碩士，研究方向：應用分子酶學。

甘肅省教育廳研究生導師基金項目（0908ZTB011）。