UPLC快速測定可溶性肽或蛋白中谷氨酰胺含量

張海華，陶冠軍，周惠明，*

（1.江南大學食品學院，江蘇無錫214122；2.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122）

UPLC快速測定可溶性肽或蛋白中谷氨酰胺含量

張海華1，陶冠軍2，周惠明1，*

（1.江南大學食品學院，江蘇無錫214122；2.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122）

建立了UPLC測定谷氨酰胺的方法。采用BTI（[bis（trifluoroacetoxy）iodo]benzene，BTI）衍生化肽或蛋白中非氮端的谷氨酰胺（Glutamine，Gln），衍生產物L-2，4-二氨基丁酸（L-2，4-Diaminobutyric acid，DABA）經2，4-二硝基氟苯（2，4-Dinitrofluorobenzene，DNFB）紫外顯色后，用超高效液相色譜儀（UPLC）在355nm下進行檢測測定。結果表明，DABA的最低檢出限為0.2ng/mL，線性范圍為1～10μg/mL。經Ala-Gln、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白和溶菌酶四種蛋白標品檢驗，測得標樣中Gln的回收率為93%±2%～98%±3%。所用方法具有檢出限低、樣品用量少、高效快速等特點。

谷氨酰胺，超高效液相色譜，L-2，4-二氨基丁酸，2，4-二硝基氟苯

谷氨酰胺是肌體在應激狀態下的“條件必需氨基酸”[1]，在人體內分布廣、含量高，具有多方面作用：它是胃腸道管腔細胞的能量來源和免疫系統的重要燃料，參與合成谷胱甘肽，增長肌肉，改善腦機能，維持腎臟、胰腺、膽囊和肝臟的正常功能等[2-5]。由于游離谷氨酰胺的不穩定和低溶解性使得谷氨酰胺單體在應用上受到限制。研究表明含谷氨酰胺的短肽在人體內具有與谷氨酰胺一樣的功能[6-8]，但是結合態谷氨酰胺在常規氨基酸測定時會發生如圖1所示的反應，導致結合態谷氨酰胺測定比較困難。關于結合態谷氨酰胺的測定方法大概有三種：一是基因或序列分析法；二是酶法，采用谷氨酰胺酶將谷氨酰胺水解成谷氨酸和氨，以此間接測定谷氨酰胺[9]；三是BTI法，非氮端谷氨酰胺經BTI處理后轉化為DABA，再經HPLC檢測[10]。三種方法中序列法準確可靠，但昂貴煩瑣，僅適于純蛋白或肽，對混合物無能為力；酶法簡便易行、價格適中，但由于谷氨酰胺酶活力問題，很難判斷谷氨酰胺是否轉化充分，結果極可能不準確；BTI法最為簡便，盡管所測谷氨酰胺為蛋白或肽非氮端谷氨酰胺，但是由于氮端谷氨酰胺在溶液中存在如圖1所示的反應，因此BTI法所測谷氨酰胺實為有效谷氨酰胺，具有較好的接受度。隨著科技的更新發展，UPLC正逐漸取代HPLC而成為液相檢測領域的主力軍。因此，本文采用UPLC對谷氨酰胺衍生物DABA進行檢測，檢測時采用DNFB對DABA及氨基酸進行衍生化，旨在對BTI法進行更新改進，建立UPLC快速測定可溶性肽或蛋白中谷氨酰胺含量的方法，使得谷氨酰胺的檢測更高效、更準確。

圖1 谷氨酰胺向焦谷氨酸、谷氨酸之間的轉化Fig.1 Conversion of glutamine into pyroglutamic acid and glutamic acid

1 材料與方法

1.1 實驗材料

L-2，4-二氨基丁酸（DABA，純度99.8%） 上海翰鴻試劑有限公司；丙胺酰谷氨酰胺（Ala-Gln，純度99.8%）、甘氨酰天冬酰胺（Gly-Asn，99.6%）、β-乳球蛋白（分子量18429u，純度99.2%）、α-乳清蛋白（分子量14000u，純度98.8%）、溶菌酶、2，4-二硝基氟苯（FDNB） 購自Sigma公司；氨基酸混合標樣（17種） 安捷倫科技有限公司；雙（1，1-三氟乙酸基）碘苯（BTI） 購自Aldrich公司；其他所用試劑 均為色譜純，購自國藥化學試劑有限公司；L-2，3-二氨基丙酸（DAPA，純度99.3%）。

1.2 實驗方法

1.2.1 BTI衍生 100μL的0.03mg/mL DABA、DAPA或0.3mg/mL標準肽溶液，加入100μL新配制的10mg/mL BTI-乙腈溶液，并加入50μL 50μmol/mL的呲啶水溶液，混合均勻后于50℃真空室內反應4h，反應結束后室溫真空抽干備用。

1.2.2 酸水解 BTI衍生樣品加入200μL 6mol/L HCl于管內，真空封管后于110℃水解24h，水解后切開封管口，真空干燥器中減壓抽干備用。

1.2.3 DNFB衍生 酸水解樣用100μL的乙腈-吡啶-三乙胺-水（10∶5∶2∶3）緩沖液溶解，真空抽干后加入100μL的同樣緩沖液，并加100μL 0.25%DNFB-乙腈溶液，密封，于50℃反應30min。

1.2.4 UPLC分析 采用配有Masslynx V4.1軟件的Waters Acquity UPLC進行谷氨酰胺含量的測定。儀器部件檢測參數：UPLC分析柱為Waters Acquity BEH C18（2.1×100mm，1.7μm），檢測器為紫外檢測器，檢測波長355nm，柱溫30℃，流速0.25mL/min，儀器配有自動進樣器，進樣量1μL；流動相梯度表見表1。

表1 流動相梯度表Table 1 Mobile phase gradient in UPLC

2 結果與分析

2.1 DABA出峰位置的確定

從圖2可以看出，DABA在8.21min時出峰，DAPA在8.08min時出峰，17種氨基酸標樣在7.50～8.50min時間段沒有出峰。這表明在測試條件下DABA峰、DAPA峰、其它氨基酸峰能夠很好地分離，這一點通過小麥面筋蛋白酶解物（WGH）中谷氨酰胺的測定色譜圖可以印證。盡管DABA峰與DAPA峰僅差0.13min，但由于UPLC高分離度，因此DABA與DAPA還是能夠完全分離的，氨基酸混標圖譜中4.26min峰和4.36min峰的分離就是很好的例子。

圖2 DABA、DAPA、氨基酸標樣色譜圖Fig.2 ChromatographyofDABA，DAPAandaminoacidsstandard

2.2 線性檢出范圍

配制0.03～0.3μg/μL的DABA和DAPA溶液，按1.2.3和1.2.4所示進行操作，制作標準曲線（圖3），得到回歸方程為：y（DABA，μg/mL）=288.56x+138.53（R2=0.9994）和y（DAPA，μg/mL）=273.30x+132.92（R2=0.9991）；DABA和DAPA的線性檢出限均為1～10μg/mL。

圖3 DABA和DAPA的標準曲線圖Fig.3 Standard curves of DABA and DAPA

2.3 定量和最低檢出限

配制不同濃度的DABA和DAPA溶液，分別取1μL注入超高效液相色譜儀，記錄色譜圖。當主成分峰高為噪音峰高的10倍時，DABA和DAPA的定量限為0.4ng；當主成分峰高為噪音峰高的3倍時，DABA和DAPA的最低檢出限為0.2ng/mL。

2.4 方法回收率

在滿足線性檢出范圍的條件下配制Ala-Gln、Gly-Asn、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、溶菌酶標準品的溶液，對其中谷氨酰胺和天冬酰胺的含量進行檢測。每個標準品重復測定8次，計算測定平均值，并與理論值相比較，得到Gln和Asn的檢測回收率（見表2）分別為：93%±2%～98%±3%和77%±3%～90%±5%。與Gln相比，標品中Asn的回收率較低，這可能是由于在BTI衍生化過程中Asn向DAPA轉化不完全造成的。這一偏低的結果也說明，通過BTI衍生化Asn的檢測方法的可行性有待商榷，新的檢測結合態Asn的方法仍需進一步研究。

表2 標準品中Gln和Asn的檢測回收率Table 2 Recovery of Gln and Asn in standard samples

3 結論

本文以BTI為衍生化試劑，將可溶性肽或蛋白的非氮端Gln轉化為DABA，而Asn轉化為DAPA。DABA和DAPA經DNFB紫外顯色后，采用超高效液相色譜能夠快速定量DABA，從而達到了間接定量肽或蛋白中Gln的目的。在本實驗條件下，全部氨基酸在12min內即能夠完成分離且方法回收率良好，比專用的氨基酸檢測儀提高了近一倍的效率。另外，在本方法儀器操作過程中，所用流動相不含難揮發鹽類（如磷酸鹽等），這對于柱子的維護和使用壽命大有好處，而且本方法在液質聯用儀上也可以放心使用。從本實驗結果來看，采用BTI衍生法定量檢測Asn的回收率不是很高，因此對于更好地檢測Asn的方法有待于研究者們更進一步的努力。然而對于那些對Asn定量檢測結果要求不是十分嚴格的實驗來說，本方法可以快速提供一個粗略結果以供參考。

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Quick determination of glutamine in soluble protein or peptide by UPLC

ZHANG Hai-hua1，TAO Guan-jun2，ZHOU Hui-ming1，*
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Wuxi 214122，China）

A method of UPLC determining glutamine was developed.Glutamine in Non-nitrogen terminal of soluble protein or peptides were accordingly converted into stable L-2，4-diaminobutyric acid（DABA）in the presence of[bis（trifluoroacetoxy）iodo]benzene（BTI）.Thereafter，that DABA reacted with 2，4-Dinitrofluorobenzene（DNFB）gave rise to a final product which was detected at 355nm by UV detector accessory for UPLC.The results showed that the lowest detection limit of DABA was 0.2ng/mL，and the linear region was 1～10μg/mL. The method recovery was tested with four standards including Ala-Gln，β-lactoglobulin，α-albumin and Lysozyme，a recovery range of 93%±2%～98%±3%was obtained.In general，the method developed has advantages of quickness，lower detection limit and less sample.

glutamine；UPLC；DABA；DNFB

TS207.3

A

1002-0306（2012）01-0338-03

2010－09－29 *通訊聯系人

張海華（1982-），女，博士研究生，研究方向：方便食品及品質改良。

國家高科技研究發展計劃863項目（2008AA10Z312）；江南大學博士基金項目（2009）。