山核桃餅粕分離蛋白的提取工藝研究

楊 瑾，董 明，曹彬彬，趙曉佳

（安徽農業大學茶與食品科技學院，安徽合肥230036）

山核桃餅粕分離蛋白的提取工藝研究

楊 瑾，董 明*，曹彬彬，趙曉佳

（安徽農業大學茶與食品科技學院，安徽合肥230036）

以山核桃餅粕為原料，利用堿溶酸沉的提取工藝，以堿提pH、料液比和堿提溫度為實驗因素，山核桃蛋白浸出率為目標建立回歸數學模型，采用二次正交旋轉組合設計實驗方法得到山核桃蛋白的最優提取條件。實驗結果表明：山核桃蛋白的最佳提取工藝為pH9.0、料液比1∶25、堿提溫度為57℃，在此條件下山核桃蛋白提取率可達到56.88%。關鍵詞：山核桃蛋白，二次正交旋轉組合設計，提取工藝

山核桃（Caryc.cathyensis Sarg），又名“小胡桃”、山核桃楸，是世界性的木本油料樹種和名優干果[1-3]。在我國栽培面積較大，主產于天目山區，安徽的寧國、績溪、歙縣和浙江的臨安、淳安等縣市區均有自然分布。安徽大別山區也有天然次生山核桃林分布，果核殼薄、出仁率和出油率均較高，是優良的果用林[4-7]。山核桃堅果千粒重3040～4425g，出仁率43.7%～49.2%；干仁蛋白質含量7.8%～9.6%，含油率69.8%～74.1%，其中不飽和脂肪酸占88.38%～95.78%[8]，氨基酸含量高達25%。山核桃果肉中還含有22種礦物質元素，特別是鈣為133mg/100g，鋅為12.59mg/100g，含量均大大高于一般干果仁。目前，僅浙江省山核桃年產量就在1萬t以上，而對于山核桃的利用除了直接食用外，大部分都用于油料榨取上，而剩余壓榨后的山核桃餅粕基本被棄去沒有被再次加工，這就使原料未能得到充分利用，很多營養成分也隨之流失，造成大量不必要的浪費[9]。目前，以山核桃餅粕為原料提取蛋白的報道較少，對于山核桃餅粕的綜合開發沒有得到足夠的重視。為了使原料得以充分利用，最大化山核桃的價值，本文以山核桃餅粕為原料，采用堿溶酸沉法提取山核桃蛋白，并結合二次正交旋轉組合設計實驗方法，建立了以蛋白質浸出率為目標函數的數學模型，重點研究了堿提pH、料液比和堿提溫度之間的關系，為山核桃蛋白的提取工藝提供了理論依據，為山核桃餅粕的資源綜合利用提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山核桃餅粕 經壓榨油后得到，含山核桃碎殼，安徽省詹氏山核桃食品有限公司提供；氫氧化鈉、檸檬酸、亞硫酸鈉 均為分析純。

DFT-100多功能中藥粉碎機 溫嶺市大德中藥機械有限公司；FA2104萬分之一電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司；KQ-500DE型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；DL-5-B飛鴿牌系列離心機 上海安亭科學儀器廠；PHB-4雷磁牌數字型pH計 上海精科雷磁公司；78-1磁力加熱攪拌器 金壇市金城國勝實驗儀器廠；Y5-1500環保型全鋼通風柜 天長市恒洋工貿有限公司；調節式萬用電爐 通州市申通電熱器廠；Scientz-12SN冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；KDN-04C消化爐 上海洪紀儀器設備有限公司；DK-S26電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理 材料帶回實驗室后，經中藥粉碎機粉碎后，過80目篩，密封備用。1.2.2 工藝流程[10]壓榨油后的山核桃餅粕→粉碎→浸泡→調pH堿性→超聲波浸提→靜置30min→4000r/min離心20min→去下層沉淀→濾液調pH酸性并攪拌→4000r/min離心20min→取沉淀層→冷凍干燥

1.2.3 山核桃蛋白提取率[11]在本實驗中蛋白質提取率以浸出率為指標。蛋白質浸出率按照下式計算：

式中：Y-浸出率，%；m1-山核桃原料蛋白的質量，g；m2-冷凍干燥后蛋白的質量，g。

1.2.4 提取工藝的單因素和二次通用旋轉組合實驗 主要以浸提方式和時間、料液比、堿提pH、堿提溫度和酸沉pH對山核桃蛋白提取率的影響，以浸出率為檢測指標，進行單因素實驗，每個實驗平行三次，取平均值。在單因素實驗的基礎上，設計3因素3水平的二次正交旋轉組合實驗，以山核桃蛋白浸出率為考核指標，確定最優提取方案和工藝參數。實驗設計見表1。

表1 二次正交旋轉組合設計因素水平表Table 1 Factors and code levels of quadratic orthogonal rotation combination design

1.3 統計分析

二次正交旋轉組合設計的實驗結果分析均在DPS數據處理軟件上運行。

式中：Dx、Dy分別為泥沙擴散系數沿x、y方向的取值；s為含沙量；Fs為底部沖刷函數，采用切應力理論表達式如下：

2 結果與分析

2.1 浸提方式和時間對山核桃蛋白提取率的影響[12]

在料液比1∶20、溫度55℃、pH8.5，用超聲波，磁力攪拌器和水浴的方法分別對山核桃粉浸提0.5、1、1.5、2h，以蛋白質浸出率為指標，確定方法和時間對提取山核桃蛋白浸出率的影響如圖1。

圖1 不同浸提方式和時間對山核桃蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of the protein extracting rate from pecan meal on different time and method

由圖1可知，利用超聲波提取山核桃蛋白較常規的方法提取率高，并且提取出來的山核桃蛋白顏色較淺，所以在以后的實驗中繼續采用超聲波方法提取。用超聲波方法浸提1、1.5、2h，所得蛋白浸出率為49%～52%之間，差異不明顯，為了節約時間和能源，在以后實驗中選取山核桃渣超聲波浸提1h為佳。

2.2 料液比對山核桃蛋白提取率的影響

在溫度55℃，pH8.5，分別按料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40的條件下對山核桃粉超聲波浸提1h，以蛋白質浸出率為指標，確定料液比對提取山核桃蛋白浸出率的影響如圖2。

圖2 料液比對山核桃蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of the protein extracting rate from pecan meal on different solid-liquid ratio

由圖2可知，隨著料液比的增加，蛋白質的浸出率也在增大，在料液比大于1∶20后，蛋白質溶出率增加緩慢。在實驗范圍內料液比為1∶30時，蛋白質溶出率最好，為49.7%，但在料液比為1∶25時，蛋白質溶出率亦達到47%。在料液比較小時，提取率不是很高，這是因為山核桃蛋白在溶液中具有一定的溶解度，在蛋白質溶解達到飽和時，過量的蛋白質不再溶解，料液比提高而提取率也不再提高。

2.3 堿提pH對山核桃蛋白提取率的影響

在料液比1∶20，溫度55℃，分別在pH為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5的條件下用超聲波方法浸提1h，以蛋白質浸出率為指標，確定堿提pH對提取山核桃蛋白浸出率的影響如圖3。

圖3 不同pH對山核桃蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of the protein extracting rate from pecan meal on different pH

由圖3可知，pH對蛋白質的提取率有明顯的影響，隨著pH的增大，提取率逐漸升高，pH＜8.5時增速比較明顯。在實驗中發現，pH的變化會影響所提取山核桃蛋白成品的顏色，而且隨著pH的增大，顏色也越來越深。在pH為9.0以上時，形成了一些酚醛類物質，使成品顏色呈現黑褐色，但在pH7.0～9.0范圍內，顏色較淺，因此選用8、8.5、9.0為堿提pH的三個水平。

2.4 堿提溫度對山核桃蛋白提取率的影響

圖4 不同溫度對山核桃蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of the protein extracting rate from pecan meal on different temperature

由圖4可知，隨著溫度的增加，山核桃蛋白質的提取率逐漸增加，超過55℃時，浸出率呈下降趨勢。這主要是由于溫度升高，引起蛋白質變性的原因造成的。溫度為55℃提取率最高，50℃和60℃次之。故選取50、55、60℃為溫度的3個水平。

2.5 酸沉pH對山核桃蛋白提取率的影響

在料液比1∶20，溫度55℃，pH8.5條件下用超聲波方法浸提1h，然后用酸調節山核桃蛋白溶液至不同pH：3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4進行酸沉淀，以蛋白質浸出率為指標，確定酸沉pH對提取山核桃蛋白率的影響。

圖5 山核桃蛋白酸沉pH的確定Fig.5 The optimum pH for pecan meal protein precipitation

由圖5可知，在pH為4.4～4.8，山核桃蛋白沉淀迅速，提取率的波動范圍不大，其中，pH為4.6時，山核桃蛋白的提取率最高。由此可以判斷，山核桃蛋白等電點為4.6左右。

2.6 二次正交旋轉組合實驗

根據單因素實驗結果，以對山核桃蛋白影響較大的pH（X1）、料液比（X2）、堿提溫度（X3）為3個實驗因素，以山核桃蛋白浸出率為目標，設計3因素3水平的二次正交旋轉組合實驗設計，用以優化山核桃蛋白的提取條件，確定pH（X1）、料液比（X2）、堿提溫度（X3）的零水平分別為8.5、1∶25、55℃，實驗設計及結果如表1和表2。

由pH、料液比、堿提溫度等3個因素對山核桃蛋白浸出率相互作用所得結果見表3。同時，根據多項式回歸方程Y=b0+∑biXi+∑bijXiXj+∑Xii2，按實驗結果計算出擬合方程的各項系數，從而得到回歸方程：Y= 52.39425+3.25832X1+0.84180X2+1.56694X3-0.36754X12-0.93853X22-1.82772X32-0.38875X1X2-0.11375X1X3-0.36625X2X3

表2 二次正交旋轉組合設計實驗方案及結果Table 2 The test scheme and results of quadratic orthogonalrotation combination design

表3 實驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of test results

由表3可知，回歸方程的失擬性檢驗F1=0.88239＜F0.01（5，8）=3.69不顯著，可認為所選用的二次回歸模型是適當的；回歸顯著性檢驗F2=17.79885＞F0.01（9，13）= 4.17極顯著，說明模型的預測值與實際值非常吻合，模型成立。對回歸系數顯著性檢驗，在α=0.10顯著水平剔除不顯著項后，得到優化后的回歸方程為：

Y=52.39425+3.25832X1+0.84180X2+1.56694X3-0.93853X22-1.82772X32。

2.6.1 單因素分析 根據實驗結果對單因素進行效應分析，結果見表4及圖6。

由表4和圖6可以看出，pH對山核桃蛋白浸出率影響最大，其次是堿提溫度，料液比對山核桃蛋白浸出率影響最小。隨著pH的增加，山核桃蛋白浸出率也隨之增加，接近線性關系，表明這個因素作用顯著，與單因素實驗基本吻合。但在實驗中發現，pH的變化會影響所提取山核桃蛋白成品的顏色，而且隨著pH的增大，顏色也越來越深。在實驗水平1.0000，此時pH為9.0時，會形成一些酚醛類物質，使成品顏色呈現黑褐色。因此選擇最優方案時要在浸出率和顏色兩個方面綜合考慮。

表4 單因素效應分析Table 4 Effective analysis of single factor

圖6 各單因素與山核桃蛋白提取率的關系Fig.6 The relationship of single factors with the protein extracting rate from pecan meal

隨著堿提溫度的增加，山核桃蛋白浸出率也逐漸增大，當堿提溫度的實驗水平為0.5000時，即溫度達到57.5℃時，山核桃蛋白的浸出率達到最高。而后溫度再升高時，山核桃蛋白浸出率則逐漸降低，主要原因是山核桃蛋白對熱比較敏感，受熱易變性。

料液比對山核桃蛋白浸出率的影響在實驗水平0.5000時達到最高，此時料液比為1∶27.5。山核桃蛋白的提取過程，其實就是山核桃蛋白的溶出過程，理論上說，料液比越大，則液相主體的溶質濃度低，傳質推動動力越大，浸取速度增加，但是料液比增大，溶劑的用量加大，溶液趨于飽和，同時溶出的其它雜質的機會也越多，因此要選擇合適的料液比。

圖7 pH（X1）與料液比（X2）的交互作用圖Fig.7 The interplay of pH（X1）and solid-liquid ratio（X2）

2.6.2 交互作用效應分析 選取一個因素固定于零水平，考察另兩個因素的交互作用，分別作圖可以直觀地分析各因子間的互作效應，結果分別見圖7～圖9。

圖7為pH（X1）與料液比（X2）的交互作用圖，由圖可知，在一定料液比（X2）下，隨著pH（X1）的升高，山核桃蛋白的浸出率呈現逐漸升高且增速趨緩的走勢，表明pH對山核桃蛋白的浸出率作用顯著。而在一定的pH（X1）下，料液比（X2）的增加即可提高山核桃蛋白的浸出率，但到達最高之后，山核桃蛋白的浸出率會隨著料液比（X2）的升高而降低，變化趨于平緩，這是因為蛋白質溶解達到飽和時，過量的蛋白質不再溶解，提取率不再提高。當pH（X1）和料液比（X2）均處于較高水平時，山核桃蛋白的浸出率都比較高。

圖8 pH（X1）與堿提溫度（X3）的交互作用圖Fig.8 The interplay of pH（X1）and temperature（X3）

圖8為pH（X1）與堿提溫度（X3）的交互作用圖，由圖可知，在一定堿提溫度（X3）下，隨著pH（X1）的升高，山核桃蛋白的浸出率逐漸升高。而在一定的pH（X1）下，堿提溫度（X3）的增加即可提高山核桃蛋白的浸出率，但到達最高之后，山核桃蛋白的浸出率會隨著堿提溫度（X2）的升高而降低，說明堿提溫度（X3）對山核桃蛋白的浸出率有很大影響。當pH（X1）水平最低，堿提溫度（X3）的水平也最低時，山核桃蛋白的浸出率達到最低。

圖9 料液比（X2）與堿提溫度（X3）的交互作用圖Fig.9 The interplay of solid-liquid ratio（X2）and temperature（X3）

圖9為料液比（X2）與堿提溫度（X3）的交互作用圖，由圖可知，在堿提溫度（X3）一定時，將料液比（X2）增加即可提高山核桃蛋白的浸出率，但到達最高之后，山核桃蛋白的浸出率會隨著料液比（X2）的升高而降低，而且在不同堿提溫度（X3）時，其變化趨勢是不同的，當堿提溫度（X3）較低時，盡管料液比（X2）升高，但山核桃蛋白的浸出率處于較低水平；在料液比（X2）的各個水平下，料液比（X2）和堿提溫度（X3）呈拋物線關系。即在一定的料液比（X2）下，當堿提溫度（X3）逐漸增加時，山核桃蛋白的浸出率隨堿提溫度（X3）逐漸增加后又降低，主要是由于較高的溫度會導致蛋白變性；兩者的相互影響表明，選取適宜的料液比（X2）和堿提溫度（X3）可使山核桃蛋白有較高的浸出率。

2.7 提取工藝的優化

由實驗結果分析可知，在實驗中不但存在著單因素效應，而且還有因素間的交互作用，因此很難從單因素效應和交互作用的結果分析中找到最佳提取條件，并且三元二次回歸的數學模型不存在提取率函數的極值，同時考慮到本實驗中溫度不宜過高、pH不宜過大等因素，因此需對回歸模型進行再解析，本實驗采用頻率分析法分析回歸模型以找到最佳提取條件，結果見表5。

表5 各變量取值的頻率分布Table 5 The probability distribution of values of each variable

由表5可知，在95%的置信區間山核桃蛋白提取效率大于50.53%時各變量的取值區間分別為0.962～1.315、-0.105～0.589、0.222～0.761，即pH為9.0～9.2、料液比為1∶24.5～1∶27.9、堿提溫度為56.1～58.8℃，在此范圍內，考慮到實際的可操作性，可將最佳工藝條件定為：pH9.0、料液比1∶25、堿提溫度為57℃，在此條件下預測值為57.04%，用此最優提取條件對其進行驗證，得山核桃蛋白提取率為56.88%，與預測值較為接近，表明本實驗結果擬合得出的回歸方程可以較好地應用于山核桃蛋白的提取。

3 結論

3.1 山核桃蛋白提取率的數學回歸模型

采用二次正交旋轉組合設計，以山核桃餅粕為原料提取山核桃蛋白，以影響山核桃蛋白提取率的pH（X1）、料液比（X2）、堿提溫度（X3）幾個因素為實驗因素設計安排實驗，得到了三元二次數學回歸模型：Y=52.39425+3.25832X1+0.84180X2+1.56694X3-0.93853X22-1.82772X32。

3.2 山核桃蛋白提取的最佳工藝的確定

對數學模型進行優化可知，山核桃蛋白提取率大于50.53%的最優提取條件為pH為9.0～9.2、料液比為1∶24.5～1∶27.9、堿提溫度為56.1～58.8℃。在此范圍內，考慮到實際的可操作性，可將最佳工藝條件定為：pH9.0、料液比1∶25、堿提溫度為57℃，在此條件下預測值為57.04%，用此最優提取條件對其進行驗證，得山核桃蛋白提取率為56.88%，與預測值較為接近，說明數學模型對山核桃蛋白的提取工藝是可行的。

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Study on extraction process of protein isolation from pecan cake

YANG Jin，DONG Ming*，CAO Bin-bin，ZHAO Xiao-jia
（College of Tea and Food Science and Technology，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China）

Pecan meal as raw material，with the extraction technology of alkali solution and acid precipitation，alkalipH，solid-liquidratioandalkalitemperature were taken as test factors.Then regression model was established to aim at leaching rate of pecan protein and obtaining the best extraction technology by orthogonal rotation. The results showed that the best pecan meal extraction technology was as follows：pH was 9.0，solid to liquid ratio was 1∶25 and temperature alkali was 57℃，the extraction rate could reach 56.88%under this condition.

pecan protein；orthogonal rotation；extraction technology

TS201.1

B

1002-0306（2012）05-0280-05

2011－05－09 *通訊聯系人

楊瑾（1986-），女，碩士研究生，研究方向：食品科學。