鹽酸林可霉素與頭孢拉定對BALB/c小鼠腸道菌群影響的比較研究

李新莉，吳大暢，張翠麗，辛毅

（大連醫(yī)科大學生物技術系，遼寧大連1 1 6 0 4 4）

鹽酸林可霉素與頭孢拉定對BALB/c小鼠腸道菌群影響的比較研究

李新莉＊，吳大暢，張翠麗，辛毅#

（大連醫(yī)科大學生物技術系，遼寧大連1 1 6 0 4 4）

目的：比較鹽酸林可霉素（LIH）與頭孢拉定（CED）對BALB/c小鼠腸道菌群的影響。方法：將BALB/c小鼠隨機分為LIH（3 3 0 mg·kg－1）組和CED（1 6 5 mg·kg－1）組，每組1 0只，分別灌服相應藥物1 0 d，停藥7 d，應用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）技術，對給藥前和給藥3、1 0 d以及停藥7 d后2組小鼠糞便中的腸道菌群進行相似性、多樣性分析及優(yōu)勢條帶的序列分析。結果：2組給藥前和停藥7 d后的腸道菌群結構相似，給藥3、1 0 d的腸道菌群結構相似，但2組給藥前后菌群結構差異較大。實驗期間2組腸道菌群均分為4個菌簇，其中LIH組給藥前糞便標本中Clostridium carboxidivorans是定植菌，給藥3 d后卟啉單胞菌成為定植菌，Clostridium carboxidivorans消失；CED組給藥前和給藥3 d的糞便標本中Clostridium carboxidivorans是定植菌，給藥1 0 d后卟啉單胞菌成為定植菌，Clostridium carboxidivorans消失；另2個菌簇在2組給藥前后均變化不大。結論：2種藥均可殺滅腸道中的定植菌Clostridium carboxidivorans，并在用藥過程中產生致病菌卟啉單胞菌，導致腸道菌群失調。

鹽酸林可霉素；頭孢拉定；聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳；小鼠；腸道菌群

鹽酸林可霉素（Lincomycin Hydrochloride，LIH），是林可霉素類抗菌藥物，對大多數(shù)革蘭陽性菌有較強的抑制作用[1]。頭孢拉定（Cefradine，CED）為第1代頭孢菌素，具有抗菌譜廣、抗菌作用強等特點[2]。這二者在臨床上均可用于治療呼吸道感染、生殖泌尿道感染及皮膚軟組織感染等[3，4]。隨著臨床的廣泛應用，二者的不良反應日漸增多，主要表現(xiàn)為腹瀉、肝腎損害、過敏反應等[5，6]。本研究將基于1 6 S rRNA基因的聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）技術應用于腸道微生態(tài)學，對DGGE指紋圖譜進行相似性、多樣性分析及優(yōu)勢條帶的序列分析，旨在比較LIH和CED對BALB/c小鼠腸道菌群的影響，為臨床合理用藥提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

JY-SPAT瓊脂糖水平電泳儀（君意東方電泳設備有限公司）；Mycycler PCR擴增儀、D-CodeTMDGGE電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 試藥

LIH膠囊（批號：H2 2 0 2 2 1 2 6，規(guī)格：每粒0.2 5 g）、CED膠囊（批號：H2 0 0 6 3 3 0 8，規(guī)格：每粒0.2 5 g）均購自長春迪瑞制藥有限公司；E.Z.N.A?糞便DNA提取試劑盒（美國Omega公司）；上游引物 GC-3 4 1 f（5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG）（引物5′端粗體部分為4 0 bp“GC夾”）、下游引物5 1 8 r（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG）、ExTaq DNA聚合酶（寶生物工程（大連）有限公司）；瓊脂糖凝膠（上海研拓生物科技有限公司）；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、尿素（進口試劑，上海雙螺旋生物科技有限公司分裝）；去離子甲酰胺（進口試劑，上海艾研生物科技有限公司分裝）。

1.3 動物

SPF級BALB/c小鼠，♀，體重1 8～2 2 g，由大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（遼）2 0 0 8-0 0 0 2。

2 方法

2.1 分組與處理

小鼠給藥劑量按照人臨床常用劑量換算。將小鼠隨機分為LIH（3 3 0 mg·kg－1）組和CED（1 6 5 mg·kg－1）組，每組1 0只，分別灌服相應藥物1 0 d，停藥7 d。分別在給藥前和給藥3、1 0 d及停藥7 d后收取每組小鼠糞便，于－8 0℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 糞便細菌基因組DNA提取

采用E.Z.N.A?糞便DNA提取試劑盒抽提各組小鼠糞便細菌基因組DNA，于－2 0℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 PCR擴增

細菌微生物區(qū)系的變化使用1 6 S rRNA基因V3可變區(qū)作為靶標進行擴增。根據(jù)參考序列[7]設計上游引物GC-3 4 1 f和下游引物5 1 8 r。擴增體系（2 5μL）為：1 0×ExTaq聚合酶緩沖溶液（含Mg2+）2.5μL，dNTP混合物 4μL，牛血清白蛋白（1 mg·mL－1）2.5μL，2 0μmol·L－1的上下游引物各0.5μL，5U·μL－1ExTaq DNA聚合酶0.2 5μL，3μL總DNA作為模板，去離子無菌水補充體系至2 5μL。PCR反應條件：預變性9 4℃5min；變性9 4℃ 3 0 s，退火5 4℃ 3 0 s，延伸7 2℃ 3 0 s，3 0個循環(huán)；最終延伸7 2℃7 min，4℃貯存。取5μL PCR產物用1%瓊脂糖凝膠

（含溴乙錠0.5 g·mL－1）電泳檢測后置于－2 0℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 DGGE電泳

2.4.1 相似性和多樣性分析。對1 6 S rRNA基因的V3可變區(qū)的擴增產物進行DGGE分析。DGGE采用8%丙烯酰胺凝膠，2 5%～6 5%（1 0 0%變性梯度包含4 0%（V/V）去離子甲酰胺和7 mol·L－1尿素）變性梯度。電泳溫度為6 0℃，以2 0 0 V電壓預電泳1 0 min，7 0 V電壓電泳4 h。電泳完成后進行硝酸銀染色，采用Quantity One 4.6.2軟件進行相似性和多樣性分析。

2.4.2 優(yōu)勢條帶的序列分析。切下DGGE圖譜中清晰且亮度高的優(yōu)勢條帶，加入2 0μL無菌水、搗碎，4℃過夜、9 0℃浸泡1 0 min，取上清液作模板進行PCR擴增，引物為去掉“GC夾”的3 4 1 f和5 1 8 r，PCR反應體系和條件同“2.3”項。PCR產物由寶生物工程（大連）有限公司測序，所得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast對比分析。

3 結果

3.1 DGGE圖譜相似性和多樣性分析

LIH組和CED組的DGGE圖譜存在類似的變化規(guī)律，2組小鼠給藥前和停藥7 d的腸道菌群在種類和數(shù)量上有相似之處，給藥后小鼠腸道菌群的種類發(fā)生變化，數(shù)量也明顯減少，特別是菌a在灌服LIH 3 d即消失，灌服CED 1 0 d幾乎消失；菌b在灌服LIH 3 d明顯增多，停藥7 d消失，灌服CED 3 d有所增加，停藥7 d消失；菌c和菌d在2組給藥前、后均變化不大。2組不同給藥周期小鼠腸道菌群DGGE圖譜見圖1。

圖12組不同給藥周期小鼠腸道菌群DGGE圖譜1、2.給藥前；3、4.給藥3 d；5、6.給藥1 0 d；7、8.停藥7 dFig 1 DGGE profiles of intestinal bacteria in mice during different administration period 1，2.before medication；3，4.3days of medication；5，6.1 0days of medication；7，8.drug withdrawal for 7 days

通過Quantity One 4.6.2軟件分別對DGGE圖譜進行UPGMA相似性聚類分析，結果見圖2。

由圖2可知，LIH組和CED組不同給藥周期小鼠均各聚成一簇，表明給藥周期相同的小鼠個體差異很小。各組給藥前和停藥7 d的小鼠腸道菌群結構相似，給藥3 d和給藥1 0 d的小鼠腸道菌群結構相似，但各組給藥前、后菌群結構差異較大。

3.2 DGGE圖譜中優(yōu)勢條帶的序列分析

通過對DGGE圖譜中的優(yōu)勢條帶進行序列分析，所得測序結果在GenBank數(shù)據(jù)庫中用Blast進行檢索和同源性比較，結果見表1。

由表1可知，菌a與Clostridium carboxidivorans的相似性為9 3%，菌b與卟啉單胞菌（Porphyromonas uenonis）的相似性為9 7%，菌c與擬桿菌（Bacteroides）的相似性為9 6%，菌d與丁酸梭菌（Clostridium butyricum）的相似性為9 7%。LIH組不同周期的糞便標本，其定植菌發(fā)生了變化：給藥前的糞便標本中Clostridium carboxidivorans是定植菌，給藥3 d的糞便標本中卟啉單胞菌成為定植菌，Clostridium carboxidivorans消失；CED組不同周期的糞便標本，其定植菌也同樣改變：給藥前和給藥3 d的糞便標本中Clostridium carboxidivorans是定植菌，給藥1 0d的糞便標本中卟啉單胞菌成為定植菌，Clostridium carboxidivorans消失；擬桿菌和丁酸梭菌在2組給藥前、后均無明顯變化。

圖2 LIH組和CED組不同給藥周期小鼠腸道菌群UPGMA相似性聚類分析1、2.給藥前；3、4.給藥3 d；5、6.給藥1 0 d；7、8.停藥7 dFig 2 Cluster UPGMA similarity analysis of different administration periods in LIH group and CED group 1，2.before medication；3，4.3days of medication；5，6.1 0days of medication；7，8.drug withdrawal for 7 days

表1 DGGE圖譜中優(yōu)勢條帶的序列分析結果Tab 1 Results of sequence analysis of DGGE dominant bands

4 討論

抗菌藥物是臨床治療感染性疾病的主要藥物，但長期大量使用抗菌藥物治療的患者，會導致腸道微生態(tài)失調，造成臨床伴發(fā)性腹瀉，引起二重感染癥狀，給治療帶來困難。

LIH和CED在臨床上應用較為廣泛，但不良反應也不容忽視，如何在治療感染性疾病的過程中合理選擇抗菌藥物，成為醫(yī)師面臨的重要問題。本研究根據(jù)DGGE能分離長度相同而序列不同DNA的原理，每一個條帶大致與小鼠腸道中的優(yōu)勢菌群相對應，條帶越多說明菌群多樣性越豐富，染色后條帶的強度強則說明該細菌的數(shù)量越多，從而反映小鼠腸道菌群的種類和數(shù)量。針對使用鹽酸林可霉素和頭孢拉定時常出現(xiàn)腹痛、腹瀉等腸道不良反應，比較二者對BALB/c小鼠腸道菌群的影響，使用基于1 6 S rRNA基因的PCR-DGGE[8]技術，分析分別灌服這2種抗菌藥物不同周期時小鼠腸道菌群結構的相似性和多樣性，進一步對優(yōu)勢條帶進行序列分析，推測出定植菌的改變是導致腸道不良反應的主要因素，且CED對BALB/c小鼠腸道菌群的有害影響小于LIH。

Clostridium carboxidivorans是人和動物體內正常的有益菌群，對多種抗菌藥物有較強的耐藥性，具有發(fā)酵能力，與丁酸梭菌類似[9]。其生長速度快，在代謝過程中產生大量丁酸、醋酸和乳酸等有機酸，加速降低了培養(yǎng)基的pH值，抑制有害菌生長、繁殖，糾正腸道菌群紊亂，減少腸毒素的發(fā)生[10]。卟啉單胞菌為致病菌，具有一系列逃避宿主防御機制及破壞宿主組織的毒性因子[11]，可以引起炎癥反應，直接導致抗菌藥物耐藥性的產生。由此推測，灌服LIH和CED導致小鼠腸道Clostridium carboxidivorans消失、卟啉單胞菌增多，是其引起腸道不良反應的主要因素。

擬桿菌在幫助宿主分解多糖、提高營養(yǎng)利用率、加快腸黏膜的血管形成、維持腸道微生態(tài)平衡等方面均有重要作用。丁酸梭菌的生態(tài)制劑臨床上用于治療病原菌所致腹瀉、腸道易激綜合征腹瀉及抗菌藥物相關腹瀉[12]等。本研究中，2組不同周期的小鼠腸道擬桿菌和丁酸梭菌變化不大，因此停藥后，菌群失調癥狀可以自然恢復。

綜上所述，LIH和CED均可殺滅腸道中的定植菌Clostridium carboxidivorans，并在用藥過程中產生致病菌卟啉單胞菌，導致腸道菌群失調；但CED對腸道菌群的有害影響要小于LIH，停藥后由于擬桿菌和丁酸梭菌的作用，失調癥狀可自然恢復。因此使用以上2種抗菌藥物時應嚴格掌握用藥指征，盡量縮短療程。

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Comparison of the Effects of Lincomycin Hydrochloride vs.Cefradine on the Intestinal Bacteria of BALB/c Mice

LI Xin-li，WU Da-chang，ZHANG Cui-li，XIN Yi
（Dept.of Biotechnology，Dalian Medical University，Liaoning Dalian 1 1 6 0 4 4，China）

OBJECTIVE：To compare the effects of lincomycin hydrochloride（LIH）vs.cefradine（CED）on the intestinal bacteria of BALB/c mice.METHODS：BALB/c mice were randomly divided into LIH group（3 3 0mg·kg－1）and CED group（1 6 5mg·kg－1）with 1 0mice in each group.They were given relevant medicine for 1 0days and stopped taking medicine for 7days.The similarity analysis，diversity analysis and the sequence analysis of the dominant bands were carried out in feces collected before and 3，1 0days after mediciation and 7days after drug withdrawal by PCR-DGGE technique.RESULTS：The intestinal bacteria were similar in structures before medication and 7days after stopped taking medicine，and the intestinal bacteria were similar in structures 3 and 1 0days after medication，there was great difference between 2groups before and after medication.During the experiment the intestinal bacteria could be divided into 4clusters.Clostridium carboxidivorans was colonized bacteria in LIH group before medication；Porphyromonas uenonis became colonized bacteria 3days after medication，Clostridium carboxidivorans disappeared.However，Clostridium carboxidivorans was colonized bacteria in CED group before and 3days after medication；and Porphyromonas uenonis became colonized bacteria 1 0days after medication，Clostridium carboxidivorans disappeared.Other 2clusters had no significant change between 2groups before and after medication.CONCLUSIONS：2drugs can both kill intestinal colonized bacteria Clostridium carboxidivorans，induce the generation of Porphyromonas uenonis during treatment and cause enteric dysbacteriosis.

Lincomycin hydrochloride；Cefradine；PCR-DGGE；Mice；Intestinal bacteria

R9 6 5；R9 7 8.1

A

1 0 0 1-0 4 0 8（2 0 1 2）3 3-3 0 8 9-0 3

DOI1 0.6 0 3 9/j.issn.1 0 0 1-0 4 0 8.2 0 1 2.3 3.0 7

2 0 1 1-0 9-0 5

2 0 1 1-1 0-2 8）