胰島素對初診2型糖尿病患者Th1/Th2平衡的影響

吳曉燕 湯旭磊 傅松波 楊 芳 高 林 (蘭州大學第一醫院內分泌科，甘肅 蘭州 730000)

2型糖尿病(T2DM)患者存在Th1/Th2細胞失衡〔1〕，研究發現胰島素(Ins)治療可能調節Th淋巴細胞的功能〔2〕。本研究擬通過測定Ins治療前后T2DM患者及正常人外周血中的Th1、Th2細胞及其 Th1/Th2比值，探討 T淋巴細胞亞群與T2DM發病的關系以及Ins對新發T2DM患者的Th1/Th2平衡的免疫調節作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象 正常對照組：20例，男12例，女8例，健康體檢者，年齡(50.5±6.0)歲，漢族，無糖尿病及其他自身免疫性疾病。糖尿病組：新診斷的T2DM患者30例，男16例，女14例，系本院內分泌科住院患者，年齡(52.9±9.7)歲，44～78歲。入組患者均無糖尿病急慢性并發癥，也無自身免疫性疾病，感染，腫瘤等。

1.2 試劑與儀器 PERCP標記的抗CD4單抗，PE標記的抗IL-4單抗，PITC標記的抗IFN-γ單抗，均為鼠抗人。FITC和PE，PERCP標記的鼠IgG1同型對照免疫球蛋白，佛波醇乙酯(PMA)，離子霉素(Ionomycin)，布雷菲德菌素 A(BFA)和Fix＆Perm破膜劑均購自美國 Caltag公司。高敏 C反應蛋白(hs-CRP)試劑盒晶美生物工程有限公司。胰島素(Ins)試劑盒天津九鼎生物技術有限公司。流式細胞儀為美國Coulter公司EPICS-XL型。

1.3 方法

1.3.1 試驗設計 對符合條件的30例患者，入組時及治療12 w后查HbA1c、Th1、Th2空腹及 OGTT2h血糖、空腹及 OGTT 2 h胰島素，血清hs-CRP，并記錄體重變化。試驗期間，盡量使空腹血糖小于7.0 mmol/L、餐后2h血糖小于10 mmol/L為滿意，根據血糖調整Ins用量。

1.3.2 Th1/Th2流式細胞術檢測 肝素抗凝血5 ml，淋巴細胞分離液分離單核細胞，將細胞數調整至1×106/ml，將細胞懸液加入24孔細胞培養板中，加入刺激劑PMA(20 ng/ml)，離子霉素(1 μg/ml)和蛋白質轉運抑制劑BFA(2 μg/ml)以阻止細胞因子向細胞外分泌。37℃，5%CO2環境下培養5 h，對細胞表面抗原進行染色，加入破膜劑進行固定-破膜打孔以利于細胞因子單抗進入細胞，進行細胞內細胞因子染色，每管加入10 μl INF-γ單抗和IL-4單抗，以相應的同種型對照IgG單抗作對照染色，應用流式細胞儀對分泌INF-γ的CD4+細胞Th1和分泌IL-4的CD4+細胞Th2進行檢測。

1.3.3 血清hs-CRP的測定 取晨起空腹靜脈血2 ml，用ELISA測定。單位為ng/ml。正常參考值為254～16 104 ng/ml。

1.3.4 血糖、胰島素及相關指標的測定 空腹10 h取晨血5 ml測定空腹血糖(FBG，葡萄糖氧化酶法)、空腹血清胰島素(FINS、放射免疫法)、Homa B胰島素分泌指數=20×空腹胰島素/(空腹血糖－3.5)是評價胰島β細胞分泌功能的一個指標，胰島素敏感性指數(ISI)=ln〔1/空腹血糖(mmol/L)×空腹胰島素(mU/L)〕是評價胰島素抵抗的一個指標。糖化血紅蛋白(HbA1c)，免疫分析法，德國Bayer公司DC2000型HbA1c檢測儀及檢測試劑盒。

1.4 統計學方法 采用SPSS8.0統計軟件包。正態資料以s表示，偏態資料經對數轉換后按正態資料數據處理，組間比較用單因素方差分析，再以SNK行組間兩兩比較。相關分析用直線相關。

2 結果

2.1 各組臨床資料比較 T2DM患者Ins治療前的Th1百分比，Th1/Th2比值較正常對照組明顯下降(P＜0.05)，Th2與正常對照組無明顯差異，血清hs-CRP濃度顯著高于正常對照組(P＜0.01)，Homa B較正常組顯著下降(P＜0.01)。T2DM患者Ins治療后與治療前相比Th1細胞百分比顯著性升高(P＜0.05)，Th2細胞百分比下降，但無統計學意義(P＞0.05)，治療前后Th1/Th2比值相比差異有顯著性(P＜0.05)。Homa B較治療前顯著上升，差異有統計學意義(P＜0.01)。C反應蛋白較治療前明顯下降，差異有統計學意義(P＜0.05)。治療后Th1、Th2細胞百分比、Th1/Th2比值與對照組比較差異無顯著性(P＞0.05)。見表1。

表1 2型糖尿病患者治療前后與正常人臨床及實驗室資料比較(s)

表1 2型糖尿病患者治療前后與正常人臨床及實驗室資料比較(s)

與正常對照組比較：1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;與治療前比較：3)P ＜0.05，4)P ＜0.01

Homa B ISI T2DM治療前 24.02±0.70 10.93±0.702) 1.99±0.281) 2.82±0.35 0.76±0.062) 9.70±1.011) 33 281±1 1682) 25.8±7.92)組別 BMI(kg/m2)FBG(mmol/L)Th1(%)Th2(%)Th1/Th2 HbA1c(%)hs-CRP(ng/ml)－2.73±0.27 T2DM治療后 24.62±0.43 6.54±0.824)2.89±0.313)2.23±0.27 1.35±0.083)6.21±0.833)16 564±1 0453)69.8±11.44)－2.56±0.22正常對照組 23.32±0.57 5.00±0.26 3.28±0.21 2.45±0.22 1.45±0.12 5.00±0.74 10 073±1 177 86.3±17.1 －2.22±0.14

2.2 T2DM患者外周血Th1/Th2淋巴細胞及血清hs-CRP水平與ISI相關性 T2DM患者外周血Th1淋巴細胞值與HbA1c具有明顯的相關性(r=－0.68，P＜0.01)，患者Th2及Th1/Th2與HbA1c之間無相關性(P＞0.05)。Th2淋巴細胞值與Homa B具有明顯的相關性(r=－0.54，P＜0.01)。T2DM患者血清hs-CRP水平與ISI呈顯著負相關(r=－0.38，P＜0.01)。

3 討論

研究認為T2DM可能是炎癥因子介導的免疫炎癥反應，炎癥因子導致了胰島B細胞分泌胰島素功能受損及產生胰島素抵抗〔3，4〕。CD4+T輔助細胞(Th)是構成機體免疫系統的一種主要細胞，Th1細胞主要負責細胞免疫應答、遲發性超敏反應(炎癥反應)、Th2細胞與體液免疫有關。生理條件下，機體的Th1細胞和Th2細胞處于相對平衡狀態，在疾病狀態下，這種平衡被打破，Th1，Th2細胞所致不同優勢免疫應答與疾病的發生，發展，預后有關。近來Th1/Th2細胞與糖尿病的關系日益受到關注，Katz等〔5〕認為Th1細胞有可能促進1型糖尿病的發生，而Th2細胞對1型糖尿病有保護作用，Th1/Th2細胞的失衡在1型糖尿病的發生中發揮了重要的作用。本研究發現與1型糖尿病不同，新診斷的T2DM患者Th1細胞百分比降低，而Th2細胞百分比升高，Th1/Th2比值明顯下降，提示T2DM是一種Th2占優勢的疾病。本研究還發現，T2DM患者Th1值與糖化血紅蛋白呈負相關，Th2淋巴細胞值與Homa B具有明顯的負相關，提示Th1細胞劣勢所致的細胞免疫缺陷可能引起了高血糖的發生，Th2淋巴細胞的升高導致了胰島β細胞分泌功能的下降。雖然Th2與正常人比無差異，但Th1細胞亞群的改變導致了Th2亞群的變化，Th2型細胞因子促進B細胞活化，而產生過量IgG，也可促進殺傷性T淋巴細胞克隆的過度激活，該作用與其他細胞因子和效應分子產生的細胞毒作用結合，可以引起胰島β細胞死亡〔6〕，Th2細胞因子可能也通過體液免疫途徑參與了T2DM患者的發病。

近來研究顯示，在T2DM的早期給予胰島素短期強化治療，可以帶來長期改善血糖控制的作用，可以使患者及時回到T2DM自然病程的早期階段〔7〕。Ins是一種廣泛調節細胞功能的激素，體外研究發現，低濃度的Ins可抑制Th2類細胞因子分泌而增加Th1類細胞因子分泌，能通過調節淋巴細胞分泌Th1/Th2細胞因子的作用而影響免疫系統功能〔8〕研究發現Ins除了使1型糖尿病胰島β細胞得到充分休息外，還可能調節T淋巴細胞Th2亞群，恢復Th1/Th2之間的平衡，胰島素可促進Th2功能，抑制Th1細胞殺傷能力，減少對胰島β細胞的免疫殺傷〔9〕。研究發現，胰島素能誘導NOD小鼠抗原特異性調節T細胞產生，通過分泌IL-4，IL-10，TGF-β在胰島內抑制Th1型細胞及其他效應細胞，使IFN-γ表達顯著下調，從而保護胰島免受破壞，分泌胰島素維持正常血糖〔10〕。

本研究發現胰島素治療后T2DMTh1升高，Th2降低，從而使Th亞群平衡向Th1方向漂移。減輕了炎癥反應，改善了胰島β細胞的分泌功能。本文發現，T2DM患者外周血中Th1、Th2水平與上述1型糖尿病患者結果呈現相反的情形，Th1細胞表現下降趨勢，Th2細胞表現上升趨勢。提示不同類型的糖尿病，Th細胞亞群表現不同的細胞優勢，這一結論尚需后續的大量研究進一步探討。故目前尚不能簡單認為對于糖尿病患者來說，Th1細胞一定有益，而Th2細胞一定有害，而應從Th1/Th2失衡方面去進行更為深入的研究。

1 吳曉燕，湯旭磊，高 林.2型糖尿病免疫炎癥的初步探討〔J〕.中國免疫學雜志，2007;23(10)：944-6.

2 The EURODIAB Substudy 2 Study Group1.Decreased prevalence of atopic diseases in children with diabetes〔J〕.J Pediatr，2000;137：470-4.

3 邱明才.糖尿病的多器官免疫損傷〔J〕.國際內分泌代謝雜志，2006;26(3)：215-6.

4 Fsta A，Agostno RD，Howeard G，et al.Chronic subclinical inflammation as part of the insulin resistance syndrome〔J〕.Circulation，2001;102(1)：42-7.

5 Katz JD，Benoist C，Mathis D.T helper cell subsets in insulin-dependent diabetes〔J〕.Science，1995;268(5214)：1185-8.

6 John A，Colwell MD.Inflammation and diabetic vascular complications〔J〕.Diabetes Care，1999;22(12)：1927-8.

7 祝 方，紀立農，韓學堯，等.短期胰島素強化治療誘導初診2型糖尿病患者血糖長期良好控制的臨床試驗〔J〕.中國糖尿病雜志，2003;11(1)：5-9.

8 Glasdone P，Nepom GT.The prevention of IDDM.Injecting insulin into the cytokine network〔J〕.Diabetes，1995;44：859-62.

9 高 云，何權瀛，馬艷良.胰島素對體外培養人淋巴細胞生成Thl/Th2因子平衡的調節作用〔J〕.中國糖尿病雜志，2007;15(2)：107-8.

10 Leng Q，Bentwich Z.Beyond self and nonself：fuzzy recognition of the immune system〔J〕.Scand J Immunol，2002;56(2)：224-32.