RP-HPLC法測定注射用重組人B淋巴細胞刺激因子受體-抗體融合蛋白的含量

姚雪靜，李壯林（煙臺榮昌生物工程有限公司，山東煙臺 264006）

RP-HPLC法測定注射用重組人B淋巴細胞刺激因子受體-抗體融合蛋白的含量

姚雪靜＊，李壯林（煙臺榮昌生物工程有限公司，山東煙臺 264006）

目的：建立測定注射用重組人B淋巴細胞刺激因子受體-抗體融合蛋白（簡稱TACI-Fc）含量的方法。方法：采用反相高效液相色譜法。色譜柱為Vydac C18，流動相A液為含0.1%三氟乙酸的水溶液，流動相B液為含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液，梯度洗脫，流速為1.3mL·min－1，檢測波長為280nm。結果：TACI-Fc進樣量在5.0～20.0μg范圍內與峰面積積分值呈良好線性關系（r＝0.9997）；方法平均回收率為99.71%，RSD＝1.14%（n＝9）。結論：本方法操作簡便、重復性好、結果準確，適用于測定注射用TACI-Fc的含量。

反相高效液相色譜法；重組人B淋巴細胞刺激因子受體-抗體；融合蛋白；含量

重組人B淋巴細胞刺激因子受體-抗體融合蛋白是將人B淋巴細胞刺激因子的受體TACI（一種穿膜蛋白活化物）的胞外特定可溶性部分，與人IgG1的Fc部分構建成的融合蛋白（以下簡稱TACI-Fc），用于類風濕性關節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的治療[1～3]，目前國內正處于臨床研究階段。注射用TACI-Fc中含有精氨酸、組氨酸、甘露醇等輔料，由于輔料的干擾，采用《中國藥典》[4]中常規(guī)的蛋白質含量測定方法無法對藥物活性成分進行含量測定。為控制TACI-Fc成品質量，筆者擬建立TACI-Fc含量的反相高效液相色譜（RP-HPLC）測定方法，為注射用TACI-Fc的質量評價提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1200型HPLC儀，包括紫外檢測器、四元泵、在線脫氣機、柱溫箱、自動進樣器、Chemstation色譜工作站（美國Agilent公司）。

1.2 試藥

TACI-Fc對照品（批號：BZ 2010001，溶液濃度：5.42mg·mL－1，純度：＞99.5%）、注射用 TACI-Fc（批號：20091201、20100101、20100301，規(guī)格：每支80mg）均由煙臺榮昌生物工程有限公司提供；乙腈為色譜純，水為蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Vydac C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相A液：含0.1%三氟乙酸的水溶液，流動相B液：含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液，梯度洗脫（A液從75%漸變至60%，同時B液從25%漸變至40%），洗脫時間：15min，流速：1.3mL·min－1；柱溫：25℃；檢測波長：280nm；進樣量：25.0μL。在此色譜條件下，取“2.2”項下對照品、供試品溶液、陰性對照溶液進樣分析，結果前2種溶液在相同的保留時間處出現(xiàn)吸收峰，而陰性對照溶液在此無吸收峰，說明陰性對照對試驗無干擾。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.TACI-FcFig 1 HPLC chromatogramsA.substance control；B.test sample；C.negative control；1.TACI-Fc

2.2 溶液的制備

用微量移液器精密吸取TACI-Fc對照品9.23mL，置于50mL量瓶中，加水定容，得TACI-Fc對照品貯備液（1.0mg·mL－1）。精密吸取貯備液5.0mL，置于10mL量瓶中，水定容，得TACI-Fc對照品溶液（0.5mg·mL－1）。

取注射用TACI-Fc內容物，精密稱取適量（約相當于TACI-Fc 25mg），置于50mL量瓶中，水定容，得供試品溶液。

取缺TACI-Fc的陰性樣品，精密稱取適量，置于50mL量瓶中，水定容，得陰性對照溶液。

2.3 線性關系考察

分別精密吸取TACI-Fc對照品貯備液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0mL，置于10mL量瓶中，水定容，制備成質量濃度分別為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mg·mL－1的系列濃度對照品溶液，進樣測定，以峰面積積分值（Y）為縱坐標，質量濃度（X）為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程為Y＝47.016X－8.4679（r＝0.9997）。結果表明，TACI-Fc進樣量在5.0～20.0μg范圍內與峰面積積分值呈良好線性關系。

2.4 精密度試驗

制備低、中、高濃度（0.3、0.5、0.7mg·mL－1）對照品溶液，分別進樣，計算含量。同日內重復測定5次，計算日內RSD值，結果分別為0.66%、0.79%、0.72%；連續(xù)5d制備并測定，計算日間RSD值，結果分別為1.00%、0.80%、0.86%，表明本法精密度好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液25.0μL，分別在0、4、8、12、24h 后進樣，測定峰面積。結果，RSD＝1.45%（n＝5），表明供試品溶液在24h內基本穩(wěn)定。

2.6 重復性試驗

取同一批樣品，平行制備6份供試品溶液，進樣測定。結果，RSD＝0.90%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的同一批樣品適量，置于50mL量瓶中，加入不同濃度的對照品溶液，定容。分別取樣，測定峰面積，計算加樣回收率，結果見表1。

表1 回收率試驗結果（n＝9）Tab 1Results of recovery test（n＝9）

2.8 樣品含量測定

取3批樣品，制備成供試品溶液，分別進樣，測定樣品含量。結果，3批樣品占標示含量百分率分別為97.03%、97.28%、96.55%（n＝3）。

3 論

注射用TACI-Fc為正處于臨床研究階段的一類新藥，目前尚無藥物含量測定方法的相關報道。TACI-Fc是分子量為80kD的糖蛋白，筆者試驗了測定蛋白質含量常用的酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法和Lowry法[4]。ELISA法雖然檢測精密度較高，但測試過程中重復性較差，檢測步驟煩瑣，檢測時間通常在20h以上，因此不適合作為TACI-Fc含量測定的質控方法；而由于注射用TACI-Fc中輔料的干擾，采用Lowry法測定無法得到準確的結果。

筆者以RP-HPLC法測定注射用TACI-Fc的含量，先將TACI-Fc對照品溶液進行連續(xù)波段掃描，發(fā)現(xiàn)其特征吸收峰在280nm波長處，故采用此波長進行檢測。通過調整流動相A液和B液的比例，使TACI-Fc的保留時間合適，所得到的色譜峰與其他雜質峰分離度較好。在流動相中加入0.1%三氟乙酸，改善了主峰拖尾現(xiàn)象，使主峰尖銳對稱。另外，筆者還試驗了不同流速對分析結果的影響，發(fā)現(xiàn)流速在1.0～1.3mL·min－1范圍內結果較一致，因此最后選擇流速為1.3mL·min－1，可減少分析時間。

綜上所述，本文建立的方法操作簡便、重復性好、結果準確，適用于測定注射用TACI-Fc的含量。

[1] Nestorov I，Munafo A，Papasouliotis O，et al.Pharmacokinetics and biological activity of atacicept in patients with rheumatoid arthritis[J].J Clin Pharmacol，2008，48（4）：406.

[2] Bracewell C，Isaacs JD，Emery P，et al.Atacicept，a novel B cell-targeting biological therapy for the treatment of rheumatoid arthritis[J].Expert Opin Biol Ther，2009，9（7）：909.

[3] Dall’Era M，Chakravarty E，Wallace D，et al.Reduced B lymphocyte and immunoglobulin levels after atacicept treatment in patients with systemic lupus erythematosus：results of a multicenter，phaseⅠb，double-blind，placebo-controlled，dose-escalating trial[J].Arthritis Rheum，2007，56（12）：4142.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（三部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄34.

Content Determination of Recombinant Human B Lymphocyte Stimulator Receptor-IgG Fc Fusion Protein for Injection by RP-HPLC

YAO Xue-jing，LI Zhuang-lin（Yantai RC Biotechnologies，Co.，Ltd.，Shandong Yantai 264006，China）

OBJECTIVE：To establish the method for the content determination of recombinant human B lymphocyte stimulator receptor-IgG Fc fusion protein（TACI-Fc）for injection.METHODS：RP-HPLC method was adopted.The chromatographic column was Vydac C18column with 0.1%trifluoroacetic acid in water as mobile phase A and 0.1%trifluoroacetic acid in acetonitrile as mobile phase B（gradient elution）at the flow rate of 1.3mL·min－1.The detection wavelength was set at 280nm.RESULTS：The linear range of TACI-Fc was 5.0～20.0μg（r＝0.9997）with an average recovery of 99.71%（RSD＝1.14%，n＝9）.CONCLUSION：The method is simple，reproducible and accurate for the content determination of TACI-Fc for injection.

RP-HPLC；Recombinant human B lymphocyte stimulator receptor-IgG Fc；Fusion protein；Content

R927.2；R977.6

A

1001-0408（2012）33-3144-02

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2012.33.29

＊工程師，碩士。研究方向：醫(yī)藥工程。電話：0535-6931915。E-mail：snow8176@sina.com

2011-09-22

2011-12-15）