EMMPRIN和Ki-67在panc-1荷瘤裸鼠束縛應(yīng)激模型移植瘤中的表達(dá)及意義

姜旭平 李玉軍

胰腺癌是一種惡性度高、預(yù)后極差的惡性腫瘤。近年來(lái)發(fā)病率逐年增加，雖然臨床綜合診治水平不斷提高，但對(duì)其遠(yuǎn)期療效和預(yù)后并未帶來(lái)突破性影響，患者5年生存率不足2%，因?yàn)樾睦砜謶趾蛙|體疼痛，可以推測(cè)大部分胰腺癌患者必然處于應(yīng)激狀態(tài)。本研究旨在建立裸鼠胰腺癌束縛應(yīng)激模型，模擬胰腺癌患者所處的應(yīng)激狀態(tài)，通過(guò)檢測(cè)移植瘤組織中EMMPRIN和Ki-67蛋白的表達(dá)情況，探討應(yīng)激促進(jìn)裸鼠胰腺癌移植瘤生長(zhǎng)的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 人胰腺癌細(xì)胞株panc-1(中國(guó)協(xié)和醫(yī)院微生物實(shí)驗(yàn)室);BALB/C(nu/nu)裸小鼠，雄性，4～6周齡，體質(zhì)量15～18 g(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司);EMMPRIN抗體和Ki-67抗體(北京中杉金橋生物公司)等。

1.2 方法

1.2.1 建立裸鼠胰腺癌移植瘤束縛應(yīng)激模型 新購(gòu)的裸鼠飼養(yǎng)在室溫26℃～28℃相對(duì)無(wú)菌的環(huán)境中，飼料和水均經(jīng)過(guò)高壓滅菌，將20只裸鼠隨機(jī)分為兩組:荷瘤+應(yīng)激組和單純荷瘤組，每組10只。荷瘤+應(yīng)激組的裸鼠在種瘤后給予束縛(每天10:00～18:00，共2周)，單純荷瘤組裸鼠正常活動(dòng)。結(jié)束后處死全部裸鼠，取移植瘤，具體步驟參考文獻(xiàn)［1-3］。

1.2.2 免疫組化 采用PV-6000法，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。結(jié)果判定:EMMPRIN染色陽(yáng)性細(xì)胞為胞膜呈棕黃色，Ki-67染色陽(yáng)性細(xì)胞為胞核呈棕黃色，具體判定標(biāo)準(zhǔn)按許良中等［4］所述。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析。數(shù)值資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，采用t檢驗(yàn);等級(jí)資料采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)秩和檢驗(yàn)(Mann-Whitney Test);相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)性檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 荷瘤裸鼠體質(zhì)量和瘤質(zhì)量 實(shí)驗(yàn)前兩組裸鼠體質(zhì)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［n=10，(15.76±2.07)g vs(15.67±2.22)g，t=0.091，P ＞0.05］，單純荷瘤組實(shí)驗(yàn)后體質(zhì)量明顯大于荷瘤 +應(yīng)激組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［n=10，(21.78±1.40)g vs(20.26 ±1.10)g，t=2.713，P ＜0.05］，束縛應(yīng)激使裸鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢。與單純荷瘤組相比，束縛應(yīng)激可使移植瘤質(zhì)量明顯增加［(0.96±0.41)g vs(1.45±0.42)g，t=-2.685，P ＜0.05］。

2.2 免疫組化結(jié)果 荷瘤+應(yīng)激組移植瘤組織中EMMPRIN和Ki-67的陽(yáng)性表達(dá)明顯高于單純荷瘤組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.636、-2.033，P ＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組裸鼠移植瘤組織中EMMPRIN和Ki-67的表達(dá)

2.3 EMMPRIN和Ki-67表達(dá)的相關(guān)性 裸鼠胰腺癌移植瘤組織中EMMPRIN的表達(dá)與Ki-67的表達(dá)存在正相關(guān)性(r=0.534;P＜0.05)。

3 討論

EMMPRIN屬于免疫球蛋白超家族(IgSF)成員，是一種分子質(zhì)量約50000～60000的高度糖基化的跨膜糖蛋白，在腫瘤細(xì)胞的胞膜含量豐富，可作用于鄰近的腫瘤細(xì)胞以及間質(zhì)中的成纖維細(xì)胞，分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，降解基底膜，水解腫瘤細(xì)胞表面的黏附成份，使細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與基質(zhì)間黏附力降低，而有助于癌細(xì)胞的遷移［5］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示荷瘤+應(yīng)激組移植瘤組織中EMMPRIN的陽(yáng)性表達(dá)顯著高于單純荷瘤組，提示應(yīng)激能刺激腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生分泌EMMPRIN蛋白，導(dǎo)致其活性升高，并導(dǎo)致可溶性的EMMPRIN蛋白的釋放，進(jìn)而又可通過(guò)旁分泌途徑促進(jìn)鄰近的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生MMPs和EMMPRIN，形成正反饋的調(diào)節(jié)機(jī)制，促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)。

Ki-67是一種細(xì)胞核增殖相關(guān)抗原，其表達(dá)在增殖細(xì)胞的G1、S、G2、M期，在G0期細(xì)胞中不表達(dá)，主要用來(lái)判斷細(xì)胞的增殖活性，可標(biāo)識(shí)腫瘤的增殖速度。本實(shí)驗(yàn)荷瘤+應(yīng)激組移植瘤組織中Ki-67的陽(yáng)性表達(dá)顯著高于單純荷瘤組，說(shuō)明束縛應(yīng)激增強(qiáng)了胰腺癌細(xì)胞的增殖活性，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)及其復(fù)雜的過(guò)程，需要多種因子的共同參與。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示裸鼠胰腺癌移植瘤組織中EMMPRIN與Ki-67的表達(dá)呈正相關(guān)，提示EMMPRIN高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖但EMMPRIN提高腫瘤細(xì)胞的增殖能力的確切機(jī)制目前仍不是很清楚。

總之，本文的研究結(jié)果說(shuō)明慢性應(yīng)激促進(jìn)裸鼠胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)可能是通過(guò)上調(diào)EMMPRIN的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為胰腺癌的治療提供新的思路。

［1］黃鵬，王春友，吳河水，熊炯圻.胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1中腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)行為的研究.中國(guó)普通外科雜志，2008，17(9):865-869.

［2］湯志剛，孫振陽(yáng)，胡何節(jié)，許戈良，陳炯，李建生.TFPI22對(duì)胰腺癌細(xì)胞體內(nèi)和體外侵襲能力的影響.中國(guó)普外基礎(chǔ)與臨床雜志，2008，15(1):46-50.

［3］余立群，劉福軍，高國(guó)蘭，孫玉芳，喻小念，聶春蓮，楮芳.人卵巢上皮性癌荷瘤裸鼠不良心理應(yīng)激模型的建立.中國(guó)腫瘤臨床，2009，36(20):1187-1189.

［4］許良中，楊文濤.免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn).中國(guó)癌癥雜志，1996，6(4):229-231.

［5］戰(zhàn)明僑，李玉軍.EMMPRIN和MMP一2表達(dá)與胰腺癌生物學(xué)行為關(guān)系.齊魯醫(yī)學(xué)雜志，2010，25(4):300-302.