固相萃取－高效液相色譜手性流動相添加劑法測定血漿中氧氟沙星對映體

王乃毅，白小紅

(1.山西職工醫(yī)學(xué)院，山西太原 030012;2.山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原 030001)

氧氟沙星(ofloxacin，OFLX)是20世紀(jì)80年代合成的4－氟喹諾酮類藥，它對革蘭氏陰性桿菌有強大殺菌作用，口服吸收好，體內(nèi)分布廣，不良反應(yīng)少，對多種感染有良好的療效。而氧氟沙星是外消旋體，含左旋氧氟沙星(S－(－)－OFLX)與右旋氧氟沙星(R－(+)－OFLX)。其中，左旋氧氟沙星的抗菌活性是右旋氧氟沙星的8～126倍。因此血漿中氧氟沙星的拆分對臨床安全用藥有重要意義。色譜分離手性藥物的方法有手性試劑衍生化(CDR)法，手性流動相添加劑(CMPA)法和手性固定相(CSP)法。由于其中的CMPA法［1］可采用普通的色譜柱，手性添加劑可以流出，也可更換，同時添加物的選擇范圍擴大。許多科研人員采用該法分離手性對映體［2～5］。劉學(xué)斌等［6］以甲醇－異亮氨酸手性溶液(取L－異亮氨酸1.04 g和硫酸銅1.0 g溶于1 000 mL水中)(17∶83，V∶V)為流動相，拆分優(yōu)利沙星對映體，取得了較好的結(jié)果。本實驗參考該條件對血漿中的氧氟沙星對映體進(jìn)行了分離與測定。

生物樣品的預(yù)處理是體內(nèi)藥物分析的關(guān)鍵，固相萃取技術(shù)萃取效率高，重現(xiàn)性好，雜質(zhì)干擾極低，無乳化現(xiàn)象［7］。它可以從生物樣品中提取凈化微量藥物，被廣泛用于生物樣品的檢測中。本實驗采用C18固相萃取小柱萃取血漿中的氧氟沙星，然后用高效液相色譜法 (high performanceliquid chromatogoraphy，HPLC)測定氧氟沙星對映體含量，結(jié)果更可靠，靈敏度更高。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

日本島津高效液相色譜儀(Shimadzu，LC-10ATVPLiquid Chromatograph，CTO-10A Column Oven，RF-10AXLFluorescence Detector)，20 μL定量進(jìn)樣環(huán)，AccuBOND C18固相萃取小柱(100 mg/mL，安捷倫公司)，N-2000雙通道色譜工作站(浙江大學(xué)智能信息工程研究所)，800型離心沉淀器(上海手術(shù)器械廠)，XW-80A型混旋器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)。

氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所)，奧復(fù)星(0.2%氧氟沙星注射液，北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司 0401072)，L－異亮氨酸(C6H13NO2，Bio Basic Tnc.1009S03)，CuSO4·5H2O，北京化工廠)，血漿(太原市紅十字血液中心)，其他試劑均為分析純試劑。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液:精密稱取氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品適量，用水溶解稀釋配成500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，冰箱內(nèi)4℃保存。內(nèi)標(biāo)溶液:精密稱取環(huán)丙沙星原料藥適量，用水溶解稀釋配成200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，于冰箱內(nèi)4℃保存。

1.2.2 色譜條件 色譜柱:ODS-BP柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，中國大連依利特公司);流動相:含1.31 g/L異亮氨酸和0.80 g/L硫酸銅的水溶液－甲醇(81.5∶18.5，V/V)，pH 3.3;流速:0.8 mL/min;激發(fā)波長:330 nm，發(fā)射波長:504 nm;柱溫:40℃;進(jìn)樣量:20 μL。

1.3 血漿樣品預(yù)處理

將固相萃取小柱依次用1 mL甲醇和1 mL水活化。移取0.5 mL血漿加入已活化的固相萃取小柱中，將小柱在離心機中以1 500 r/min離心2 min，用1 mL 20%的甲醇溶液沖洗小柱，再以1 500 r/min離心2 min，后用1 mL 100%的甲醇溶液沖洗小柱，以1 500 r/min離心2 min，收集最后一次甲醇洗脫液，在60℃水浴氮氣氣流下吹干，加100 μL流動相溶解殘渣，在旋渦混合儀上混勻2 min，取20 μL進(jìn)樣。

2 結(jié)果

2.1 色譜行為

在上述色譜條件下，對映體可以良好分離，分離度達(dá)到1.5以上，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對氧氟沙星的拆分無干擾。色譜圖見圖1。

2.2 工作曲線

分別精密移取空白血漿0.5 mL，置8支10 mL具塞試管中，分別加入不同濃度的氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL，再分別加入內(nèi)標(biāo)環(huán)丙沙星溶液0.3 mL、水4.0 mL稀釋，使每管含氧氟沙星分別為0.08 μg/mL、0.2 μg/mL、 0.4 μg/mL、0.8 μg/mL、 1.0 μg/mL、4.0 μg/mL、10.0 μg/mL和20.0 μg/mL，含環(huán)丙沙星均為12 μg/mL。然后各取0.5 mL，按照 1.3 步驟對樣品進(jìn)行處理和色譜分析，分別以左、右旋氧氟沙星峰面積與環(huán)丙沙星(內(nèi)標(biāo)物)峰面積之比(Y)、(Y')對氧氟沙星濃度(X)進(jìn)行線性回歸。線性方程分別為 :左旋氧氟沙星Y=–0.104+0.466X(r=0.994 5)，右旋氧氟沙星 Y'=–0.146+0.504X(r=0.994 7)。

2.3 檢測限

當(dāng)信噪比S/N=3時，血漿中的左、右氧氟沙星的最低檢測濃度均為4 ng/mL。

圖1 氧氟沙星血漿樣品色譜圖Fig 1 Chromatogram of Plasma Samples of OFLX

2.4 回收率實驗

2.4.1 萃取回收率 分別配制氧氟沙星濃度為0.2 μg/mL、1.0 μg/mL、20.0 μg/mL的血漿樣品，均取0.5 mL加入固相萃取小柱，按1.3項操作，待揮干溶劑后，用內(nèi)標(biāo)環(huán)丙沙星溶液(12 μg/mL)0.5 mL溶解殘渣，進(jìn)樣分析，得到藥物與內(nèi)標(biāo)峰面積比。另配制相應(yīng)濃度為0.2 μg/mL、1.0 μg/mL、20.0 μg/mL的對照品溶液，均取0.5 mL，用氮氣揮干，用內(nèi)標(biāo)環(huán)丙沙星溶液(12 μg/mL)0.5 mL溶解殘渣，進(jìn)樣分析，得到藥物與內(nèi)標(biāo)峰面積比。比較前后兩個比值計算萃取回收率。結(jié)果見表1。

表1 不同濃度萃取回收率實驗結(jié)果(±SD)(n=5)%Table 1 Experiment Results of the Recovery Rate of Extraction by Different Concentrations(± SD)(n=5) %

表1 不同濃度萃取回收率實驗結(jié)果(±SD)(n=5)%Table 1 Experiment Results of the Recovery Rate of Extraction by Different Concentrations(± SD)(n=5) %

0.2 89.42±2.57 2.9 86.35±3.58 4.2 1.0 88.16±2.41 2.7 90.02±2.81 3.1 20.0 91.72±2.12 2.3 87.85±2.66 3.0

2.4.2 方法回收率 分別于0.5 mL空白血漿中加入濃度分別為5 μg/mL、25.0 μg/mL、500 μg/mL的氧氟沙星溶液0.2 mL，再分別加入內(nèi)標(biāo)環(huán)丙沙星溶液0.3 mL，最后分別加水4.0 mL，搖勻，使氧氟沙星濃度分別為0.2 μg/mL、1.0 μg/mL、20.0 μg/mL，按照 1.3步驟對樣品進(jìn)行處理和色譜分析，分別測得左、右旋氧氟沙星的峰面積，并從左、右旋氧氟沙星的標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得其含量，計算回收率。結(jié)果見表2。

表2 不同濃度方法回收率實驗結(jié)果(±SD)(n=5)%Table 2 Experiment Results of the Reccvery Rate by Different Concentrations(± SD)(n=5) %

表2 不同濃度方法回收率實驗結(jié)果(±SD)(n=5)%Table 2 Experiment Results of the Reccvery Rate by Different Concentrations(± SD)(n=5) %

0.2 99.40±3.44 3.5 86.35±3.58 3.4 1.0 90.12±2.41 3.0 90.02±2.81 3.0 20.0 102.04±5.78 5.7 104.44±5.60 5.4

2.5 精密度實驗

2.5.1 日內(nèi)精密度 按照2.4.1的方法配制5 mL三種不同濃度(0.2 μg/mL、1.0 μg/mL、20.0 μg/mL)的氧氟沙星血漿，在同日內(nèi)每種分別取樣5次，按1.3“血樣預(yù)處理”項下操作，測其日內(nèi)精密度，實驗結(jié)果見表3。

表3 不同濃度日內(nèi)精密度實驗結(jié)果(±SD)(n=5)Table 3 Experiment Results of the Daily Preciseness Degree by Different Concentrations(± SD)(n=5)

表3 不同濃度日內(nèi)精密度實驗結(jié)果(±SD)(n=5)Table 3 Experiment Results of the Daily Preciseness Degree by Different Concentrations(± SD)(n=5)

0.2 0.199±0.008 4.1 0.203±0.009 4.2 1.0 0.881±0.021 2.4 0.921±0.022 2.4 20.0 20.085±0.453 2.3 20.475±0.468 2.3

2.5.2 日間精密度 按上法配制血漿樣品，每日分別取高、中、低濃度，按1.3方法操作，測定1次，連續(xù)

5 d，測其日間精密度。結(jié)果見表4。

表4 不同濃度日間精密度實驗結(jié)果(±SD)(n=5)Table 4 Experiment Results of the Between-day Preciseness Degree by Different Concentrations(± SD)(n=5)

表4 不同濃度日間精密度實驗結(jié)果(±SD)(n=5)Table 4 Experiment Results of the Between-day Preciseness Degree by Different Concentrations(± SD)(n=5)

濃度/(μg· mL－1)左氧氟沙星精密度RSD/%右氧氟沙星精密度RSD/%0.2 0.194±0.007 3.5 0.204±0.007 3.3 1.0 0.872±0.013 1.5 0.910±0.018 2.0 20.0 19.521±0.213 1.1 20.146±0.276 1.4

2.6 生物樣本血藥濃度測定

健康志愿者3名，分別口服100 mg氧氟沙星，24 h內(nèi)在13個時間點靜脈取血，離心后，收集上層血漿0.5 mL，再按1.3方法操作，分別測定其不同時間點的各藥物的血藥濃度。藥時曲線見圖2。

圖2 藥時曲線Fig 2 Concentrations of OFLX Enantiomers-Time Curves

3 討論

HPLC手性流動相添加劑法拆分手性藥物，是將手性金屬配合劑加入流動相中，與手性化合物形成三元非對映體配合物，由于其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和能量的差異，并與固定相發(fā)生立體選擇性吸引或排斥反應(yīng)，使對映體分離。此法分析成本低于手性固定相法，利于方法選擇。本實驗利用氧氟沙星對映體中羧基及鄰位羰基與手性配合劑L－異亮氨酸和Cu2+間形成三元非對映體配位化合物使血漿中左、右氧氟沙星得以分離，結(jié)果令人滿意。

固相萃取是根據(jù)液相色譜法分離原理，使液體樣品通過吸附劑保留其中某一組分，再選用適當(dāng)溶劑沖去雜質(zhì)，然后用少量溶劑迅速洗脫，從而達(dá)到分離、凈化與濃縮的目的，適用于對干擾成分多、濃度低、樣品量少等的人體生物樣品的預(yù)處理，常與HPLC技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用于生物樣品的分析［7］。本實驗采用了人工固相萃取操作，同時考察了固相萃取洗脫劑的體積、濃度、萃取時離心轉(zhuǎn)速及離心時間對藥物萃取量的影響。并考察了固相萃取小柱的重復(fù)使用情況，發(fā)現(xiàn)C18固相萃取小柱在重復(fù)使用了5次之后，精密度仍然很滿意。

本實驗應(yīng)用HPLC手性流動相添加劑法將血漿中氧氟沙星對映體進(jìn)行拆分，分離度好，比手性固定相便宜;將固相萃取與HPLC技術(shù)結(jié)合應(yīng)用于血漿中氧氟沙星的提取富集及測定，干擾雜質(zhì)少，萃取效率高;本法采用熒光檢測器，靈敏度高。

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