高效液相色譜法測定美法侖中的有關物質

王增仙，甄會賢，高蕭楓，武敏霞，李 平

(山西生物應用職業技術學院，山西太原 030031)

美法侖(又名L－溶肉瘤素)即左旋苯丙氨酸氮芥，是一種烷化劑。其基本作用同環磷酰胺，為雙功能烷化劑及細胞周期非特異性藥物，有細胞毒作用，并抑制蛋白質的合成，為苯丙氨酸氮芥的左旋體，抗瘤作用稍強于消旋體(即溶肉瘤素)。臨床上美法侖可用于乳腺癌、卵巢癌、慢性淋巴細胞和粒細胞白血病、惡性淋巴瘤及多發性骨髓瘤等，動脈灌注可治療肢體惡性腫瘤，如惡性黑色素、骨肉瘤及軟組織肉瘤等。目前國內尚無美法侖的檢測標準。為控制其質量，本文根據新藥審批的有關規定要求，結合國外已有的標準，采用常用測定有關物質的高效液相色譜法考察美法侖中有關物質的檢測方法［1～3］。

1 儀器與材料

日本島津LC-10A高效液相色譜儀，島津紫外分光光度儀UV-160，醫用超聲波清洗器 KQ320，恒溫水浴鍋，電子天平。

美法侖原料(自制)，對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:20081204)，乙腈為色譜純，甲醇、氫氧化鈉、鹽酸、雙氧水、碳酸銨、冰醋酸均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件及系統適用性實驗

色 譜 柱:DiamonsilODS(4.6 mm× 150 mm，5 μm);流動相:0.375%碳酸銨的水溶液∶乙腈∶冰醋酸 (100∶35∶1.0);檢 測 波 長:260 nm;流 速:1.0 mL/min;進樣量:10 μL。理論塔板數按美法侖峰計不低于5 000，拖尾因子在0.95～1.05之間，與相鄰峰的分離度大于1.5。色譜圖見圖1、圖2、圖3。

圖1 空白溶液色譜圖Fig 1 HPLC Chromatograms of the Blank Solution

圖2 供試品溶液色譜圖Fig 2 HPLC Chromatograms of the Sample

圖3 對照品溶液色譜圖Fig 3 HPLC Chromatograms of the Reference Diosgenin

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 取本品適量，精密稱定，加0.1 mol/L鹽酸溶液溶解并定量稀釋制成每1 mL中含0.2 mg的溶液，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱定美法侖對照品適量，加0.1 mol/L鹽酸溶液配制成0.2 mg/mL的溶液作為儲備液。精密量取儲備液1 mL置于100 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸稀釋至刻度并搖勻，即得濃度為0.002 mg/mL的溶液。

2.2.3 空白溶液的制備 0.1 mol/L鹽酸溶液。

2.3 方法

2.3.1 檢測限和定量限的確定 調節色譜儀靈敏度，用0.1 mol/L的鹽酸溶液配制一定濃度的美法侖溶液，并逐步稀釋，邊稀釋邊進樣，每次10 μL，直到美法侖峰的峰高為基線噪音的10倍左右，記錄色譜圖，根據稀釋倍數計算，得定量限為0.000 002 6 mg/mL，繼續稀釋，當美法侖峰的峰高為基線噪音的3倍左右時，記錄色譜圖，得檢測限為0.000 000 8 mg/mL。

2.3.2 線性測定及范圍 選擇從定量限到1%自身對照濃度的120%作為本品的線性考察范圍，本品的定量限為 0.000 002 6 mg/mL，1%自身對照濃度的120%為 0.002 4 mg/mL， 故 在 0.000 002 6 mg/mL～0.002 4 mg/mL范圍內做線性實驗。

精密稱定美法侖對照品適量，加0.1 mol/L鹽酸溶液配制成0.2 mg/mL的溶液作為貯備液。精密量取貯備液適量，用0.1 mol/L鹽酸溶液分別稀釋成濃度為0.000 002 6 mg/mL、0.000 2 mg/mL、0.001 mg/mL、0.002 mg/mL、0.002 4 mg/mL的溶液，進樣分析。得線性方程:Y=7 000X+1 635，r=0.999 7。結果表明本品在0.000 002 6～0.002 mg/mL范圍內呈良好的線性關系。

2.3.3 儀器精密度實驗 取對照溶液適量，連續進樣5次，每次10 μL。以峰面積值計算相對標準偏差RSD為1.2%(n=5)。實驗結果表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩定性實驗 取供試品溶液適量，分別于配制后第0、1、2、3、5 h末進樣分析，其峰面積的 RSD 為1.28%，表明供試品在5 h內穩定性良好。

2.4 回收率實驗

采用加樣回收率測定法，取本品適量，精密稱定，加0.1 mol/L鹽酸溶解并定量稀釋制成每1 mL中含0.1 mg的溶液，共9 份，分別按50%、100%、150%精密加入對照品溶液適量各3份，按上述條件進樣分析，計算加樣回收率和RSD值。3個濃度的平均回收率分別為 100.8%、99.1%、98.6%;RSD 分 別 為 0.93%、0.52%、0.89%。

2.5 破壞性實驗

2.5.1 氧化破壞實驗 取本品約10 mg，加30%雙氧水15 mL，于90℃加熱2 min，濾過，取續濾液進樣10 μL，結果表明降解產物峰明顯增大，且有關物質峰和主峰達基線分離。色譜圖見圖4。

圖4 氧化破壞色譜圖Fig 4 HPLC Chromatograms of the Oxidative Damage

2.5.2 酸破壞實驗 取本品約10 mg，加入0.1 mol/L鹽酸溶液10 mL，于90℃加熱40 s，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液中和至中性，濾過，進樣10 μL，結果表明降解產物峰明顯增加，且有關物質峰和主峰達基線分離。色譜圖見圖5。

2.5.3 堿破壞實驗 取本品約10 mg，加入0.1 mol/L氫氧化鈉溶液5 mL，于80℃加熱40 s，用0.1 mol/L鹽酸溶液中和至中性，濾過，進樣10 μL，結果表明降解產物峰明顯增加，且有關物質峰和主峰達基線分離。色譜圖見圖6。

圖5 酸破壞色譜圖Fig 5 HPLC Chromatograms of the Acid Damage

圖6 堿破壞色譜圖Fig 6 HPLC Chromatograms of the Base Damage

2.6 三批樣品有關物質的檢測

照上述色譜條件進行實驗，分別取對照品溶液、供試品溶液10 μL注入液相色譜儀;記錄色譜圖至供試品溶液中美法侖峰保留時間的3倍;則供試品溶液中如有雜質峰(溶劑峰除外)，計算各雜質峰峰面積之和，測定結果見表2。

表2 3批樣品有關物質測定結果Table 2 Determination Results of Related Substances in Three Batches of Samples

3 討論

3.1 測定波長的選擇

取本品原料分別用流動相溶液、0.1 mol/L的鹽酸溶液，配制成適宜濃度的溶液，分別在190～400 nm波長范圍內進行紫外掃描，美法侖的流動相溶液在260 nm處有最大吸收;其0.1 mol/L的鹽酸溶液也在260 nm處有最大吸收，所以最終選擇260 nm為有關物質的檢測波長。

3.2 溶劑的選擇

在有關物質的測定中，首選采用流動相溶解樣品，經穩定性試驗，發現本品在流動相溶液中穩定性不好，其有關物質自溶解后有逐漸增加的趨勢，所以采用本品片劑溶出度測定的溶劑(0.1 mol/L鹽酸)來溶解樣品，檢驗有關物質，增加了溶液穩定性，且空白溶劑不影響測定。

［1］劉利軍.反相高效液相色譜法測定普盧利沙星中的有關物質［J］.中南藥學，2010，8(6):423-425.

［2］白玉紅，韓 慧，于海威，等.鹽酸氮卓斯汀片有關物質測定方法的研究［J］.中國當代醫藥，2009，16(12):115-116.

［3］張小松，江 生，毛 慶.磷酸哌喹有關物質的檢測研究［J］.中國藥事，2009，23(7):690-691.