引進木霉菌株T-43對樟子松枯梢病菌的抑制效果

鄧 龍 鄧 勛 尹大川 宋瑞清*

(1.黑龍江省林業科學研究院，哈爾濱 150081；2.東北林業大學 林學院，哈爾濱 150040)

樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolica)是我國北方主要造林樹種，在生態建設、環境修復方面發揮著重要作用。樟子松枯梢病是由松球殼菌(Sphaeropsissapinea(Fr．)Dyko et Sutton)引起的一種發生普遍、危害性大的世界性傳染性病害。松枯梢病屬于寄主主導性病害，對該病害的控制應以提高寄主抗性及降低病原菌種群數量為主要方向[1]。

木霉菌(Trichodermaspp.)是自然界中資源豐富的拮抗微生物，具有抗菌譜廣、適應性強和多機制性的特點[2]。首先，木霉菌競爭作用強，它能迅速生長，進行營養和空間位點的競爭；它能產生揮發性或非揮發性的抗菌類物質，如木霉素、膠霉素、綠色木霉素和抗菌肽等, 對多種病原菌有抑制作用；此外還具有重寄生作用, 通過胞外酶破壞病原菌細胞壁，削弱病原菌的生長勢, 甚至殺死病原菌。目前世界范圍內已有以木霉菌為主要成分的生物殺菌劑，在農林業生產中發揮重要作用[3]。同時，木霉菌對植物還具有促生抗逆的作用，通過定殖和次生代謝產物促進植物生長[4]，提高其抗病能力。本研究在前期研究基礎上，利用篩選獲得的高效木霉菌株T-43對樟子松枯梢病菌進行室內抑菌研究，制備不同劑型菌劑進行野外應用研究，為進一步研究木霉菌對樟子松枯梢病菌的抑菌機理并開發穩定的生物菌劑打下基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

(1)木霉菌株：菌株T-43為自以色列引進的菌株，保存于東北林業大學森林微生物研究中心。

(2)病原菌株：樟子松枯梢病菌-松球殼菌(Sphaeropsissapinea)，分離自遼寧省防風固沙研究所章古臺實驗林場的樟子松人工林，保藏于東北林業大學林學院森林微生物研究中心。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株T-43對樟子松枯梢病菌生長的影響

(1)菌株T-43對病原菌的拮抗效果

采用平板對峙培養法[5]。用0.5cm孔徑無菌打孔器分別切取PDA平板培養基上培養3d的木霉菌株和病原菌株菌餅，接種于PDA平板培養基上，間隔5cm。以單獨接種病原菌株和木霉菌株的平板培養作為對照，每處理3次重復。置于25℃恒溫培養箱中培養，每8h測量一次菌落半徑。計算被抑制率、菌絲生長速度和相對抑制效果，對拮抗線進行觀察和描述，統計競爭系數。

對峙培養中競爭系數分級標準見表1。

表1 菌株對峙培養中競爭系數分級標準

被抑制率(%)=(對照菌落直徑-對峙培養菌落直徑)/對照菌落直徑×100%

相對抑制效果=病原菌株被抑制率/拮抗菌株被抑制率

(2)菌株T-43非揮發性代謝產物對病原菌的抑制效果

非揮發性代謝產物的制備：將菌株T-43接種到PDA平板培養基上活化3d，用0.5cm無菌打孔器切取菌餅3片，接種于300 mL PDA培養基中，恒溫振蕩培養(25℃，150r/min)7d后，用8層紗布過濾。取濾液，減壓旋轉蒸發濃縮到原體積的1/10，備用。

抑菌活性測定：采用生長速率法。將上述非揮發性代謝產物添加到PDA培養基中(終濃度20%)，搖勻，倒平板，待冷卻凝固后，接入病原菌。以不添加代謝產物的PDA平板培養作為對照。置于25℃恒溫培養5d后，采用十字交叉法測量病原菌菌落直徑，計算木霉非揮發性代謝產物對病原菌生長的抑制率，每處理3次重復。

1.2.2 菌株T-43防治樟子松枯梢病的野外應用研究

試驗地點：遼寧省固沙所章古臺實驗林場的樟子松人工林內。

野外施用時間：2010年7月10日、7月20日和7月30日，防治三次。

試驗菌劑：采用孢子粉劑和液體菌劑兩種。T-43孢子粉劑濃度為1.7×107個孢子/g，液體菌劑為發酵液原液。

施用方法：施用菌劑前調查所選樹木的病情指數。采用樹冠噴霧的方式施藥。每個濃度梯度防治20株樹，設3個重復，設定空白對照。

2010年9月調查病情指數，利用SPSS統計軟件進行差異顯著性分析。

病害損失估計采用分級計數法，以病情指數表示發病程度，病情指數計算：

病情指數=[∑(病級株數×代表數值)/株數總和×最重一級代表數值]×100

防治效果=(對照區病情指數-防治區病情指數)/對照區病情指數×100%

2 結果與分析

2.1 菌株T-43對樟子松枯梢病菌生長的影響

對峙培養48h后，菌株T-43對病原菌生長抑制率為60.17%(表2、圖1)，木霉菌株生長速度快，競爭系數高，在同病原菌對峙培養中，迅速占領生態位。而病原菌在木霉抑制下幾乎停止生長，并最終被木霉菌覆蓋。菌株T-43與病原菌拮抗培養形成明顯的拮抗線。菌株T-43對病原菌的相對抑制效果達到6以上。菌株T-43次生代謝產物中含有高效抑菌活性成分(圖1)，其原液對病原菌的抑菌率為92.94%。

表2 菌株T-43與病原菌對峙培養結果

2.2 菌株T-43的野外應用研究

木霉菌劑對樟子松枯梢病具有顯著的控制效果，不同濃度梯度菌劑的防治效果存在顯著差異(表3)。液體菌劑(木霉次生代謝產物)防治效果高于孢子粉劑。液體菌劑10倍液對樟子松枯梢病的控制效果超過94%，隨著稀釋倍數的增大，防治效果逐漸降低，100倍液防治效果只有61.33%。孢子粉劑中，300倍液對病害的控制效果最好，也只有68%。

表3木霉菌株T-43菌劑防治樟子松枯梢病2010年統計結果

劑型濃度防治前/后各等級株數ⅠⅡⅢⅣ防治前/后病情指數防治效果孢子300X020/10/6033.33/43.3368.42粉劑500X040/10033.33/5052.64700X020/10/15033.33/58.3321.061000X000/15033.33/58.3321.062000X020/50/18033.33/63.335.27液體10X020/50/1033.33/3594.73菌劑20X020/20/3033.33/38.3384.2140X020/10/6033.33/43.3368.42100X090/7033.33/4561.33對照020/10/19033.33/65720/1420/1320/1

3 結論

通過木霉菌株T-43對樟子松枯梢病菌的室內外生物測定結果，得出以下結論：菌株T-43非揮發性代謝產物中含有高效抑菌活性成分，對樟子松枯梢病具有明顯的控制效果。

參考文獻：

[1]黃敬林，張立，高波，等.樟子松枯梢病研究進展[J].東北林業大學學報，2005,33(2):83～85.

[2]朱廷恒，邢小平，孫順娣.木霉T97菌株對幾種植物病原真菌的拮抗作用機制和溫室防治試驗[J].植物保護學報，2004,31(2)：139～144.

[3]Francesco V.,Krishnapillai S.,Emilio L. Trichoderma-plant-pathogen interactions[J].Soil Biology & Biochemistry,2008,(40):1～10.

[4]F. Vinale, K. Sivasithamparamb. A novel role for Trichoderma secondary metabolites in the interactions with plants[J].Physiological and Molecular Plant Pathology,2008，(72): 80～86.

[5]Morton, D.T., Stroube, N.H. Antagonistic and stimulatory eVects of microorganisms upon Sclerotium rolfsii[J].Phytopathology,1955,(45):419～420.

[6]宋漳，陳輝. 綠色木霉對土傳病原真菌的體外拮抗作用[J].福建林學院學報, 2002, 22(3): 219～222.