獼猴桃白蘭地專(zhuān)用酵母菌的選育及鑒定*

田殿梅，張良，，盧中明，，秦輝，侯長(zhǎng)軍，霍丹群

1(重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶，400044)2(國(guó)家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州，646000)

獼猴桃又名陽(yáng)桃、茅梨，果實(shí)中除了含有大量VC外，還含有糖、鈣、鎂、鐵、磷、有機(jī)酸以及多種氨基酸，是人們所喜愛(ài)的特色水果。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)栽培獼猴桃面積已達(dá)4萬(wàn)余公頃，年產(chǎn)量達(dá)到近9萬(wàn)t。有關(guān)人士預(yù)測(cè):我國(guó)現(xiàn)有的獼猴桃在全部進(jìn)入盛果期后，產(chǎn)量會(huì)超過(guò)目前的消費(fèi)需求。目前，獼猴桃的貯藏保鮮技術(shù)尚不完善，銷(xiāo)售方式以鮮果為主，造成大量鮮果積壓與腐爛，因此，對(duì)其進(jìn)行深加工是發(fā)展的必然趨勢(shì)。在釀酒方面，由于原料供應(yīng)充足，具有顯著的資源優(yōu)勢(shì)，有利于保護(hù)果農(nóng)的栽培積極性，帶動(dòng)地方經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。目前，我國(guó)在獼猴桃酒釀制過(guò)程中，缺乏獼猴桃酒專(zhuān)用菌種，使用的酵母基本是AADY活性酵母或是葡萄酒酵母，它不是獼猴桃釀酒的理想酵母，獼猴桃酒用酵母最好從成熟的獼猴桃果實(shí)上分離選育，性能可滿足發(fā)酵徹底、產(chǎn)香能力強(qiáng)、產(chǎn)酸能力適度、對(duì)酒的風(fēng)味貢獻(xiàn)大等基本要求。本試驗(yàn)通過(guò)富集培養(yǎng)和劃線分離源自成熟獼猴桃果皮、果汁自然發(fā)酵液中的微生物，并進(jìn)行有效的分離篩選，通過(guò)穩(wěn)定性測(cè)試、發(fā)酵力測(cè)試、發(fā)酵及蒸餾結(jié)果分析，篩選出適合獼猴桃白蘭地的優(yōu)良釀酒酵母［1－4］，并通過(guò)ITS1－5.8S－ITS2 rDNA區(qū)域序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)篩選菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定［5］。

1 材料與方法

1.1 材料儀器

獼猴桃，四川長(zhǎng)青縣海沃特品種;葡萄糖、酵母膏、蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限公司;TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)，Amresco;安琪酵母，安琪酵母股份有限公司。

7890 A/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀;美國(guó)Agilent公司;BIO-RAD mylyder，PCR擴(kuò)增儀;SW-CG－1C超凈工作臺(tái)，蘇凈安泰;LDZX－50KBS高壓蒸汽滅菌鍋:上海申安醫(yī)療器械廠

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

TTC下層培養(yǎng)基:葡萄糖10.1 g，蛋白胨2.0 g，酵母浸膏1.5 g，酸性磷酸鉀 1.0 g，硫酸鎂 0.4 g，檸檬酸 0.27 g，瓊脂 30.0 g，水 200 mL。

TTC上層培養(yǎng)基:TTC 0.05 g，葡萄糖0.5 g，瓊脂 1.5 g，水 100 mL。

YPD培養(yǎng)基:酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉 20 g，加水至 1 000 mL。

1.2.2 酵母菌的分離

用腐爛獼猴桃的果皮及部分果肉加到新鮮獼猴桃汁中發(fā)酵后取發(fā)酵液25 mL，用無(wú)菌水稀釋至250 mL，通過(guò)梯度稀釋方法將稀釋液接種至TTC分離培養(yǎng)基中培養(yǎng)，挑選出產(chǎn)酒精能力強(qiáng)的紅色菌株［6］，并通過(guò)劃線培養(yǎng)進(jìn)行分離純化菌株，觀察單菌落的形態(tài)大小，將分離出的單菌落接種于YPD斜面試管中，28℃培養(yǎng)2 d，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 酵母菌的初篩

采用杜氏管發(fā)酵法，將10 mL獼猴桃汁加入試管中，滅菌冷卻后加入酵母菌，在相同的培養(yǎng)條件下，測(cè)定菌株產(chǎn)氣能力，初步比較各株酵母菌的起酵能力和發(fā)酵能力，篩選發(fā)酵性能優(yōu)良的菌株。記錄產(chǎn)氣時(shí)間和產(chǎn)氣量，重復(fù)3次。活化條件:28℃條件下，10°Brix麥芽汁恒溫振蕩10 h:發(fā)酵條件:28℃條件下，獼猴桃汁靜止發(fā)酵 48 h;接種量:l×106CFU/mL［7］。

1.2.4 酵母菌的復(fù)篩

按1×106CFU/mL的接種量，將篩選出的各菌種分別接至500 mL成分調(diào)整后的獼猴桃果漿中20℃培養(yǎng)，比較各酵母發(fā)酵力，以安琪釀酒酵母為對(duì)照菌株;待發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行初次蒸餾，蒸餾條件:過(guò)濾發(fā)酵產(chǎn)物，取濾液400 mL，添加蒸餾水400 mL，功率選擇600 W，截取濾液400 mL供分析檢測(cè)。按照GB15038—2005規(guī)定的方法對(duì)各酵母釀造酒液進(jìn)行理化測(cè)定［8］。獼猴桃果漿成分調(diào)整方法:用葡萄糖調(diào)整糖度至18%，用CaCO3調(diào)整果漿至pH3.6，SO2添加量為75 mg/L。

1.2.5 氣相色譜-質(zhì)譜分析條件

色譜柱條件:進(jìn)樣口溫度250℃，起始溫度50℃，保留3 min，以 5℃/min升至 220℃，保留 30 min，載氣 He，檢測(cè)器溫度250℃。質(zhì)譜條件:電離方式 EI，電離電壓70 eV，恒壓10 Pa，連接桿溫度280 ℃，進(jìn)樣口溫度為 250 ℃ 。［9］

1.3 菌株鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將菌種接種到盛有 YPD固體培養(yǎng)基的平板中，28℃ 培養(yǎng)2～3 d后涂片，用美蘭對(duì)細(xì)胞染色后鏡檢，觀察其細(xì)胞形態(tài);將活化好的酵母在產(chǎn)孢子培養(yǎng)基上劃線，25℃ 培養(yǎng)3 d，鏡檢是否有子囊孢子。

1.3.2 分子生物學(xué)鑒定

1.3.2.1 基因組DAN提取

收集過(guò)夜培養(yǎng)的酵母細(xì)胞，在液氮中充分研磨后用4 mLDNA提取液溶解并轉(zhuǎn)移至1.5 mL滅菌的離心管中，加入與離心管中DNA提取液等體積的氯仿-異戊醇(V∶V=24∶1)，劇烈振蕩后 13 000 r/min離心。取上清液用等體積氯仿-異戊醇重復(fù)處理1次。加入等體積預(yù)冷的異丙醇，混勻后于－20℃下靜置15 min，13 000 r/min 離心 7 min。沉淀用 100 μL 70%無(wú)水乙醇各洗滌1次，真空抽干后加入50 μL無(wú)菌水，溶解后－20℃下保藏備用［10］。

1.3.2.2 ITS1－5.8S－ITS2 rDNA序列擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃變性1 min，55℃退火 1 min，72℃ 延伸 2 min，共循環(huán) 35次，最后72℃延伸10 min，4℃保存，PCR產(chǎn)物純化后測(cè)序。反應(yīng)體系(25 μL)為:模板 DNA 3 μL 引物ITS1(10 mol/L)和 ITS4(10 mol/L)各 1μL，dNTPs(2.5 mmol)1 μL ，buffer 2.5μL，Taq 酶1 μL，用滅菌的雙蒸水將體系補(bǔ)齊至25 μL。

1.3.2.3 克隆

對(duì)擴(kuò)增的ITS1－5.8S－ITS2 rDNA序列進(jìn)行純化(按PCR產(chǎn)物純化試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作)，然后與克隆質(zhì)粒PUM-T載體連接(參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū))，4℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞后，涂于含有 Amp(100 μg/mL)、IPTG(0.5 mmol/L)，X-gal(80 μg/mL)的LB平板上，倒置培養(yǎng)過(guò)夜。用滅菌牙簽挑取孵性克隆至5 mL的LB培養(yǎng)基(含5 μL 50 μg/mL Amp)中.37℃下200 r/min搖床培養(yǎng)24 h。

1.3.2.4 序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

將培養(yǎng)24 h的菌液送至華大基因有限公司進(jìn)行測(cè)序，得到菌株P(guān)CR擴(kuò)增片段的原始序列。在Gen-Bank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)得到的序列進(jìn)行比對(duì);為進(jìn)一步顯示供試菌株和已知酵母菌的親緣關(guān)系及系統(tǒng)地位，根據(jù)同源序列搜索結(jié)果，采用MEGA5.0軟件，Neighbour-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并進(jìn)行1 000次 Bootstrap 檢驗(yàn)［11］。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的初篩

在TTC顯色平板上共選取紅色較深的菌落23株，酵母菌在含有杜氏小管的試管中20℃發(fā)酵48 h產(chǎn)氣能達(dá)到約等于杜氏小管滿體積的酵母菌有10株，說(shuō)明這些酵母菌起酵能力比較強(qiáng)，可能有較高的發(fā)酵度和發(fā)酵效率，將這10株酵母菌作為出發(fā)菌株進(jìn)行復(fù)篩。杜氏小管產(chǎn)氣情況如表1所示。

表1 杜氏小管產(chǎn)氣情況

2.2 酵母菌的復(fù)篩

將初篩到的10株酵母菌及對(duì)照菌株安琪釀酒酵母分別接種到20°Brix的獼猴桃果漿中20℃發(fā)酵10 d，測(cè)定其殘?zhí)恰⒕凭燃翱偹岫龋绫?所示。

表2 酵母菌發(fā)酵性能情況

通過(guò)GC-MS［12］分析不同酵母釀造的白蘭地香氣成分得知，獼猴桃白蘭地酒中的非酒精揮發(fā)物，包括高級(jí)醇、酯類(lèi)物質(zhì)、揮發(fā)酸、以及醛酮類(lèi)物質(zhì)是主要的香氣成分。這四類(lèi)物質(zhì)在獼猴桃白酒中的含量比較如圖1。

圖1 各株酵母產(chǎn)高級(jí)醇、酯、醛酮及酸類(lèi)物質(zhì)能力比較

由圖1可以看出N5和N13酵母釀造的白蘭地產(chǎn)酯性能均較其他酵母優(yōu)秀，同時(shí)其刺激性香氣成分包括高級(jí)醇、醛酮類(lèi)物質(zhì)及酸類(lèi)物質(zhì)的含量較其他酵母釀造的白蘭地均處于較低的水平。

其中具體香氣成分中對(duì)獼猴桃白蘭地貢獻(xiàn)較大的主要有β-苯乙醇(PEA)、乙酸乙酯及丁酸乙酯，其中β苯乙醇(PEA)是一種帶有淡雅細(xì)膩玫瑰氣味的芳香醇;丁酸乙酯具有菠蘿芳香氣味;乙酸乙酯具有果香味。這些物質(zhì)在獼猴桃白蘭地中的含量比較如圖2。

由圖2可以看出各組酵母產(chǎn)β-苯乙醇的能力基本處于相同的水平，而N5產(chǎn)乙酸乙酯及丁酸乙酯的能力明顯優(yōu)于其他酵母，其中乙酸乙酯的含量為0.094 4 g/L，丁酸乙酯的含量為0.122 0 g/L;N13酵母發(fā)酵產(chǎn)物中乙酸乙酯含量為0.150 g/L。

圖2 各株酵母產(chǎn)β-苯乙醇、丁酸乙酯及乙酸乙酯能力比較

2.3 菌株形態(tài)學(xué)觀察:

N5和N13酵母菌在PDA平板上培養(yǎng)2 d后形成的菌落呈橢圓形或卵圓形，乳白色，表面隆起，邊緣整齊，表面光滑，無(wú)光澤，質(zhì)地粘稠，聞其有酒香味;菌體細(xì)胞呈卵圓形，細(xì)胞為兩端及多端出芽生殖(圖3)。

圖3 N5和N13酵母菌落形態(tài)及顯微照片

2.4 DNA提取和PCR擴(kuò)增結(jié)果

以ITS1和ITS4為引物通過(guò)酵母菌特異性PCR反應(yīng):擴(kuò)增得到ITS1－5.8S－ITS2 rDNA序列擴(kuò)增產(chǎn)生的DNA片段為單一條帶，大小長(zhǎng)度約為760bp，擴(kuò)增產(chǎn)物無(wú)明顯非特異擴(kuò)增現(xiàn)象，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 N5與N13酵母ITS1－5.8S－ITS2 rDNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.5 ITS1－5.8S－ITS2 rDNA序列相似性

對(duì)兩株菌株的ITS－5.8S－ITS2序列進(jìn)行分析，并將得到的序列與NCBI Gen-Bank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性序列搜索。比對(duì)結(jié)果顯示，這2株菌株與葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)的相似性均達(dá)到99%，利用 MEGA 5.0軟件，Neighbor Joining方法構(gòu)建兩株酵母與相關(guān)菌種的ITS1－5.8S－ITS2rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)行1000次的相似度重復(fù)計(jì)算(圖5):結(jié)果表明，N5酵母和N13酵母均能與FR751341.1 Hanseniaspora uvarum聚在一起，與其遺傳距離最近，并且置信度均達(dá)到97%。據(jù)此可以認(rèn)為菌株N5與N13均屬于Hanseniaspora uvarum有孢漢遜酵母屬。

圖5 N5和N13酵母ITS1－5.8S－ITS2 rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 結(jié)論

本研究從腐爛的獼猴桃果實(shí)自然發(fā)酵液中成功分離得到2株釀造性能優(yōu)良的酵母菌株N5和N13，在接種量為1×106CFU/mL、初始糖度為 18°Brix、SO2濃度為75 mg/L、初始pH值為3.6、發(fā)酵溫度為20℃時(shí)，發(fā)酵10天，經(jīng)過(guò)一次蒸餾后得到的白蘭地在酒精度、乙酸乙酯及丁酸乙酯的含量方面均明顯優(yōu)于安琪酵母在相同條件下的釀造產(chǎn)物。經(jīng)形態(tài)學(xué)和ITS1－5.8S－ITS2 rDNA分子生物學(xué)鑒定二者與葡萄汁漢遜酵母的相似度達(dá)到99%，通過(guò)構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)得知，二者與葡萄汁漢遜酵母屬于同種的置信度達(dá)到97%，據(jù)此可以認(rèn)為菌株N5與N13均屬于Hanseniaspora uvarum有孢漢遜酵母屬。

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