超高效液相色譜-串聯質譜法測定人血漿中硝苯地平的濃度

尤曉明，董吉，沈國榮（蘇州大學附屬第一醫院，江蘇蘇州215006）

超高效液相色譜-串聯質譜法測定人血漿中硝苯地平的濃度

尤曉明＊，董吉，沈國榮#（蘇州大學附屬第一醫院，江蘇蘇州215006）

目的：建立測定人血漿中硝苯地平濃度的方法。方法：采用液-液萃取法處理血漿后以超高效液相色譜-串聯質譜法進樣測定。色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18，流動相為甲醇-10mmol·mL－1甲酸銨水溶液（85∶15），流速為0.2mL·min－1，正離子多離子反應監測（MRM）掃描分析，離子通道分別為m/z 347.14→315.15（硝苯地平）、m/z 384.10→338.10（非洛地平）。結果：硝苯地平血藥濃度在1～200ng·mL－1范圍內線性關系良好（r＝0.9980），定量下限為1ng·mL－1，提取回收率為68.2%～71.2%，方法回收率為94.0%～106.5%，日內、日間RSD均＜11%。結論：本方法操作簡便、快速、特異性強、靈敏度高，可用于硝苯地平的藥動學研究。

硝苯地平；超高效液相色譜-串聯質譜法；藥動學；血藥濃度

硝苯地平為二氫吡啶類鈣拮抗藥，是繼腎上腺素β受體阻滯藥之后國際上公認的重要心血管系統藥。2007年發表的國內心血管系統藥物利用調查中，硝苯地平為臨床選擇頻率最高品種之一[1]。文獻報道了血漿中硝苯地平的高效液相色譜（HPLC）-紫外檢測法[2]，近年來也有應用液-質聯用（LC-MS）法進行硝苯地平藥動學研究的文獻報道[3]，但有關用超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）法進行硝苯地平體內濃度測定及藥動學研究的報道較少。本文旨在建立一種簡便、靈敏、準確地測定血漿中硝苯地平濃度的方法，滿足硝苯地平藥動學研究的需要。

1 材料

1.1 儀器

Acquity UPLC超高效液相色譜儀、Quattro Premier三重四級桿串聯質譜儀（美國Waters公司）；Millipore Synergy?UV超純水機（美國Millipore公司）；5804R高速低溫離心機（德國Eppendorf公司）；XS105DU電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；微量移液器（德國Eppendorf公司）。

1.2 試藥

硝苯地平對照品（常州四藥制藥有限公司，含量：99.4%，批號：20100409）；內標：非洛地平對照品（浙江蘇泊爾藥業有限公司，含量：99.5%，批號：30557-200501）；硝苯地平緩釋膠囊（哈藥集團制藥總廠，規格：每粒20mg，批號：A091000206，有效期：24個月）；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜及質譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18（100mm×2.1mm，1.7μm）；流動相：甲醇-10mmol·mL－1甲酸銨水溶液（85∶15），等度洗脫；流速：0.2mL·min－1；柱溫：30℃；進樣量：7.5μL。

電噴霧離子源（ESI），正離子多反應監測（MRM）掃描；毛細管電壓：1.5kV；錐孔電壓：12V；離子源溫度：120℃；脫溶劑溫度：350℃；脫溶劑氣流速：650L·h－1；錐孔氣流速：50L·h－1。硝苯地平和非洛地平的離子通道分別為m/z 347.14→315.15和m/z 384.10→338.10。

2.2 受試者選擇與試驗設計

20名中國男性健康受試者，年齡（23.0±1.9）歲，身高（171±8）cm，體重（58±8）kg。試驗前經病史詢問，體檢，胸部透視，心電圖、血尿常規、血生化檢查，各項指標均正常；受試者無藥物過敏史和藥物依賴史，無精神病史及其他慢性病史；受試前2周及試驗期間未服用任何其他藥物；受試期間禁煙、酒及其他含咖啡因、茶堿等的飲料，避免劇烈運動；研究前簽署知情同意書，并經蘇州大學附屬第一醫院醫學倫理委員會批準。試驗前禁食10h，于次日7：00時空腹服用硝苯地平緩釋膠囊（20mg），服藥后4h禁食。受試者于給藥前和給藥后0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、15.0、24.0、36.0h時，由肘正中靜脈取血3mL，并立即移入抗凝管中離心（3500×g）10min，分離血漿，于－70℃保存待測。

2.3 血漿樣品處理

精密吸取人血漿樣品200μL，加內標溶液（500ng·mL－1非洛地平）30μL，渦旋振蕩30s，加入乙醚1.2mL，渦旋振蕩1min，11895×g離心5min，取上層液1.0mL至離心管，氮氣吹干，加流動相120μL復溶，渦旋振蕩4min，20817×g離心5min，取上清液90μL移至進樣瓶，進樣7.5μL分析。全部分析測定操作均在避光下進行。

2.4 數據處理

藥動學分析采用非房室模型，以梯形法計算AUC0～t，由消除相末端濃度點計算t1/2和Ke，以末端點濃度和Ke的比值計算AUC0～∞，達峰濃度（cmax）和達峰時間（tmax）為實測值。

3 結果

3.1 質譜分析

硝苯地平和非洛地平在ESI離子化方式下，主要生成[M+H]+準分子離子峰，分別為m/z 347.14和m/z 384.10。選擇上述離子峰進行二級質譜分析，硝苯地平和非洛地平的主要碎片離子分別為m/z 315.15和m/z 338.10，并將其作為定量分析時檢測的產物離子。典型的碎片離子圖見圖1。

圖1 碎片離子圖A.硝苯地平；B.非洛地平Fig 1Ion map of fragmentA.nifedipine；B.felodipine

3.2 方法特異性

在血漿測定條件下，硝苯地平和非洛地平的保留時間分別為1.46min和2.08min，見圖2。6種不同來源的血漿中內源性雜質，不干擾藥物和內標測定，可見方法具有良好的特異性和分離度。

圖2 硝苯地平和內標非洛地平的典型多離子反應監測（MRM）色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+10ng·mL－1硝苯地平+內標；C.志愿者服用硝苯地平緩釋膠囊20mg 2h后的血樣Fig 2Typical MRM chromatograms of nifedipine and internal standard felodipineA.blank plasma；B.blank plasma+10ng·mL－1nifedipine+internal standard；C.blood sample of volunteers 2h after oral administration of Nifedipine sustained-release capsules 20mg

3.3 標準曲線的制備及定量下限考察

在空白血漿中分別加入不同量的硝苯地平標準溶液，配制成質量濃度分別為1、2、5、10、20、50、100、200ng·mL－1的血漿標準樣本。按“2.3”項下方法操作后進樣測定，記錄色譜。以質量濃度為X軸，樣品與內標的峰面積比為Y軸，進行線性回歸計算，經“1/X2”權重得回歸方程為：Y＝0.02384X+0.00117（r＝0.9980），結果表明，硝苯地平血藥濃度在1～200ng·mL－1范圍內線性關系良好。取空白血漿，加入硝苯地平標準溶液，配制最低定量點血漿樣本200μL各6份（濃度為1ng·mL－1），處理后測定，結果精密度和準確度考察結果分別為5.3%和104.0%，表明測定血漿中硝苯地平的定量下限可達1ng·mL－1。

3.4 精密度及回收率試驗

取空白血漿，加入不同量的硝苯地平標準溶液，配制低、中、高（2、20、150ng·mL－1）3種濃度血漿樣本200μL各6份 ，連續測定3批，求得回收率及日內、日間RSD，見表1。

表1 精密度及回收率試驗結果Tab 1Results of precision and recovery test

3.5 提取回收率試驗

測定低、中、高（2、20、150ng·mL－1）3種濃度的質控血漿樣本各6份，得到峰面積A1；同時取空白血漿按“2.3”項下方法處理后，加入適量硝苯地平和內標工作溶液，配制成與血漿質控樣本理論進樣溶液相同濃度的溶液進樣分析，得峰面積A2。以A1/A2的比值求算硝苯地平的提取回收率，詳見表1。

3.6 基質效應

取6種不同來源的空白血漿，提取后，每種空白基質制備低、中、高（2、20、150ng·mL－1）3種進樣濃度的樣本，將其峰面積與進樣溶劑中添加相同量的硝苯地平和內標工作溶液的峰面積進行比較，求算硝苯地平和內標非洛地平的基質效應。基質因子（MF）＝（空白基質中添加化學品峰面積/進樣溶劑中添加化學品峰面積）×100%。如MF＞100%則為離子增強，MF＜100%則為離子抑制。結果顯示，低、中、高質控樣本中硝苯地平的MF為96.1%、98.6%、95.5%，非洛地平的MF為90.4%，結果見表2。

表2 血漿中硝苯地平的基質因子Tab 2MF of nifedipine

3.7 穩定性試驗

考察處理后硝苯地平血漿樣本在自動進樣器（8℃）放置24h，血漿樣本室溫避光放置8h、3次凍融以及－70℃凍存66d的穩定性。結果表明，經處理的血漿樣本在自動進樣器中（8℃）放置24h，血漿樣本室溫避光放置8h、經過3次凍融、－70℃凍存66d仍能保持穩定。

3.8 在藥動學研究中的應用

20名健康受試者口服硝苯地平緩釋膠囊20mg后藥動學參數見表3；20名受試者口服硝苯地平緩釋膠囊20mg平均藥-時曲線見圖3。

4 討論

相比HPLC法，采用柱填充顆粒1.7μm的UPLC方法具有更高的分辨率、更快的分析速度、更好的選擇性和特異性。本試驗采用UPLC技術，大大提高了分離度，僅需3min就達到了分析的目的，減少了有機溶劑的消耗。

由于硝苯地平遇光不穩定，所以操作均在避光條件下進行。曾試用乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷等有機溶劑進行液-液萃取，結果發現乙醚提取吹干迅速，可縮短前處理的時間，減少樣品的降解，故選作萃取劑。

基質效應是影響基于質譜的生物分析方法的因素之一。基質效應的定量檢測可以用MF來表示，它定義為當基質離子存在時待測物峰響應值與基質離子不存在時待測物峰響應值的比值。MF＝1表明基質效應不存在；MF＜1表明存在離子抑制；MF＞1表明可能存在離子增強。一個可靠的生物分析方法并不要求絕對MF接近1，但是，如果單個受試者的MF之間差異大則會造成分析重現性較低。為了檢驗來自單個受試者的樣品MF差異，本試驗中測定了來自6個受試者基質的MF。MF的差異性由相對標準偏差（RSD）來衡量，RSD＜15%，則可滿足美國FDA生物分析方法的要求[4]。

筆者建立了測定人血漿中硝苯地平濃度的UPLC-MS/MS法，定量下限為1ng·mL－1；低、中、高3種濃度的日間和日內RSD＜11%；采用液-液萃取法進行樣品處理，簡單易行。結果表明本法準確、快速、特異性強、靈敏度高，適用于硝苯地平緩釋膠囊的藥動學研究。

表3 20名受試者口服硝苯地平緩釋膠囊20mg后的藥動學參數Tab 3 Pharmacokinetic parameters of nifedipine in 20healthy volunteers after oral administration of nifedipine sustained-release capsules 20m（g

表3 20名受試者口服硝苯地平緩釋膠囊20mg后的藥動學參數Tab 3 Pharmacokinetic parameters of nifedipine in 20healthy volunteers after oral administration of nifedipine sustained-release capsules 20m（g

藥動學參數cmax/n g·mL-1 tmax/h t1/2/h A U C0～36h/n g·h·mL-1 A U C0～∞/n g·h·mL-1數值52.7±31.23.0±1.45.4±2.6363.8±177.5377.4±179.0

圖3 20名受試者口服硝苯地平緩釋膠囊20mg后的平均藥-時曲線Fig 3 Mean plasma concentration-time curves of nifedipine in 20healthy volunteers after oral administration of nifedipine sustained-release capsules 20mg

[1] 馮 琳，侯孝云，孟 玲，等.2005年長江流域157家醫院心血管系統藥物利用分析的應用[J].中國新藥與臨床雜志，2007，26（3）：175.

[2] Zendelovska D，Simeska S，Sibinovska O，et al.Development of an HPLC method for the determination of nifedipine in human plasma by solid-phase extraction[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2006，839（1-2）：85.

[3] 張 靜，宋浩靜，卜凡龍，等.LC-MS法測定人血漿中硝苯地平的濃度及其在藥代動力學中的應用[J].中國藥學雜志，2010，45（6）：314.

[4] Boulanger B，Rozet E，Moonen F，et al.A risk-based analysis of theAAPS conference report on quantitative bioanalytical method validation and implementation[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2009，877（23）：2235.

Determination of Nifedipine Concentration in Human Plasma by UPLC-tandem Mass Spectrometry

YOU Xiao-ming，DONG Ji，SHEN Guo-rong（The First Affiliated Hospital of Soochow University，Jiangsu Suzhou 215006，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the determination of nifedipine concentration in human plasma.METHODS：The plasma procedure involved a single-step liquid-liquid extraction，then chromatographed on a Waters Acquity UPLC BEH C18column with mobile phase consisted of methanol-10mmol·mL－1ammonium formate（85∶15）at the flow rate of 0.2mL·min－1.The protonated ions of analytes were detected in positive ionization in multiple reaction monitoring mode（MRM）.The mass transition pairs of m/z 347.14→315.15and m/z 384.10→338.10were used to detect nifedipine and felodipine.RESULTS：The linear range of nifedipine was 1～200ng·mL－1（r＝0.9980）and the lowest limit of quantitation was 1ng·mL－1.The extraction recovery rates were ranged from 68.2%to 71.2%，and method recoveries were 94.0%～106.5%.RSDs of intra-day and inter-day were all less than 11%.CONCLUSION：The method is simple，quick，specific and sensitive，and suitable for the pharmacokinetics research of nifedipine.

Nifedipine；UPLC-tandem mass spectrometry；Pharmacokinetics；Plasma concentration

R969.1

A

1001-0408（2012）46-4355-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2012.46.13

2012-10-09

2012-10-30）