非洲豬瘟與豬瘟雙重PCR方法的建立與初步應用

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非洲豬瘟與豬瘟雙重PCR方法的建立與初步應用

張倩 劉明團 （山東省青島市畜牧獸醫研究所 266100）

根據GenBank中公布的非洲豬瘟病毒Vp72蛋白基因序列(GenBank登錄號AY261364)合成陽性質粒P-ASFVP72，采用OIE推薦的PCR引物，擴增片段大小為278bp。另根據GeneBank上公布的豬瘟疫苗株(GenBank登錄號AF531433)的全基因組序列，利用生物學軟件設計一對引物，構建陽性質粒P-CSFV，擴增片段為424bp。以兩種陽性質粒為模板，通過對反應條件的優化，建立了一種可同時檢測這兩種病毒的雙重PCR方法。試驗結果證明，該方法可在同一個體系中同時對兩個目的基因進行擴增，并且特異性強、敏感性高，具有省時，省力，快速，高效等特點，為ASFV和CSFV的臨床診斷和流行病學調查等研究提供了有效的技術支持。

非洲豬瘟病毒； 豬瘟病毒 雙重PCR

豬瘟(Classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的豬的一種高度接觸性傳染病，其在世界范圍內流行并引起巨大的經濟損失。CSF在我國流行多年，是養豬業的頭號殺手[1]。20世紀50年代，我國學者研制成功豬瘟兔化弱毒疫苗并大范圍應用以后，成功控制了CSF在我國的流行。但隨著時間的推移，在疫苗免疫的壓力下，CSFV基因變異趨向逐漸遠離疫苗株[2]。因此，對CSFV的監測也顯得格外重要。

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的家豬和野豬的一種急性、高度接觸性傳染病，又稱東非豬瘟或疣豬病。臨床以高熱、食欲廢絕、皮膚和內臟器官出血為主要特征，一般發病后2~10d死亡，嚴重時死亡率可達100%。該病屬于世界動物衛生組織(OIE)要求必須報告的A類動物疫病，我國將其列為一類動物疫病[3, 4]。

非洲豬瘟的臨床癥狀和病理變化均與急性豬瘟相似，特征是高熱，死亡率極高，尸檢可見網狀內皮系統大面積出血，必須通過分子生物學方法加以診斷區別。目前ASF雖尚未在我國發現，但已在非洲、歐洲和美洲的數十個國家流行，造成巨大的經濟損失且已蔓延至與歐洲接壤的多個亞洲國家。隨著世界經濟全球化趨勢的發展，自然生態環境的改變，該病毒從西非向東非、歐洲、亞洲傳播的態勢已經形成，對我國潛在威脅越來越大。因此，建立一種可同時鑒別診斷這兩種病毒的方法是非常必要和迫切的[5-6]。

利用生物信息學軟件比較了CSFV 疫苗株與石門株的全基因組序列發現其5’非編碼區具有高度的保守性，針對此區域設計一對引物，與構建的CSFV質粒和合成的ASFV引物及質?；旌显谕惑w系內進行檢測。通過對PCR反應條件的優化，建立CSFV和ASFV雙重PCR檢測方法，該方法對CSFV和ASFV的最低檢出量均可以達到pg級別。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株與質粒 CSFV疫苗株，購自青島易邦生物工程有限公司；ASFV質粒是參照非洲豬瘟病毒Vp72蛋白基因序列(GenBank登錄號AY261364)，由上海英杰(Invitrogen)生物公司合成；PPV、PRV、PCV-2、PRRV均為本實驗室保存；大腸桿菌DH5α，由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 RNA、DNA提取試劑盒購自羅氏公司；反轉錄試劑盒、PCR試劑(包括10×Buffer，dNTPs，Taq DNA聚合酶等)、DNA Marker DL 2000、Agarose、IPTG、X-Gal，均購自TaKaRa公司；DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自德國QIAGEN公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成 參考OIE《陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》(第五版)，合成一對引物，此引物為OIE推薦的檢測非洲豬瘟病毒的PCR引物。根據Genbank上已發表的CSFV C株5’UTR的序列，應用Primer5.0軟件對其保守區設計一對引物。由大連寶生物公司合成。序列如下：ASFV72-1 5’-ATGGATACCGAGGGAATAGC-3’ASFV 72-2 5’-CTTACCGATGAAAATGATAC-3’ CSFV-1 5’-ATT TGGTTCAGGGCCTCC-3’ CSFV-2 5’-CTCCGAACAATGG TCTCCC-3。

1.2.2 模板的制備 參照非洲豬瘟病毒Vp72蛋白基因序列(GenBank登錄號AY261364)由生物公司合成一段大小為278bp的陽性質粒，命名為P-ASFVP72。用Roche公司的試劑盒提取CSFV疫苗株的總RNA，擴增目的片段。反應體系參照TaKaRa公司 One Step RNA PCR Kit說明書。反應條件為：50℃反轉錄30min；94℃ 3min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，35cycles；72℃ 7min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產物。用QINGEN試劑盒回收目的片段并連接到pMD-18T載體上。將連接產物轉化Ecoli DH5α感受態細胞，挑斑，擴大培養，抽提重組質粒進行鑒定并送上海生工測序，選取基因序列正確的質粒作為模板，將此陽性質粒命名為P-CSFV。用核酸蛋白紫外分析儀準確定量質粒的質量濃度和純度(連續測定5次，取均值)。

1.2.3 mPCR條件的優化 PCR反應體系為25μl，其中10*buffer 2.5μl，dNTP 2μl，Taq 酶(5U/μl)0.5μl，模板各2μl，上下游引物采用不同濃度，滅菌超純水補足至25μl。PCR反應條件為：95℃ 5min；94℃ 30s，不同退火溫度45s，72℃ 30s，35個循環；72℃延伸7min。（1）退火溫度：退火溫度采用55℃、57℃、58℃、60℃進行優化，確定最佳退火溫度。（2）引物濃度：分別采取引物終濃度0.2、0.4、0.6、0.8pmol/μl 4個稀釋度進行優化，確定最佳引物濃度。

1.2.4 特異性試驗 以PRV、PPV、PCV-2的DNA、PRRSV和CSFV的cDNA 、ASFV質粒為模板，用已確定的最佳條件進行PCR反應，來確定該方法的特異性。

1.2.5 敏感性試驗 將ASFV和CSFV 模板進行10倍梯度稀釋，用已確定的最佳條件進行PCR反應，來確定該方法的敏感性。

1.2.6 臨床樣品的檢測 從山東聊城地區某豬場的死豬采取病變組織樣品(腦、肝、肺、脾、腎等)，疑似豬采取血液，分別提取RNA和DNA，將RNA反轉錄為CDNA，用已建立的雙重PCR方法和單項PCR同時進行復核檢測，來確定該方法的準確性。

2 結果與分析

2.1 陽性質粒鑒定結果

通過PCR反應鑒定目的片段已正確連接到載體上，分別是424bp和278bp。見圖1。

2.2 雙重PCR條件優化結果

2.2.1 退火溫度的確定 以ASFV和CSFV混合質粒為模板，應用兩對特異性引物進行擴增，采用不同的退火溫度進行PCR反應，結果發現55℃時擴增效果較好。見圖2。

2.2.2 引物濃度的確定 采用不同的引物濃度進行PCR反應，結果發現采用0.6~0.8pmol/μl時擴增效果均較好。見圖3。

圖1 M：DNA分子質量標準；1：CSFV陽性質粒；2：ASFV陽性質粒

圖2 M：DNA分子質量標準；1~4：退火溫度分別是55℃、57℃、58℃、60℃擴增結果

圖3 M：DNA分子質量標準；1~4：引物濃度分別為0.8、0.6、0.4、0.2pmol/μl擴增結果

圖4 M：DNA分子質量標準；1~6分別為ASFV、PCV、PPV、PRV、CSFV、PRRSV的核酸為模板擴增結果；7為陰性對照

2.3 特異性試驗

按已優化的PCR反應條件，分別以提取的PCV、PPV、PRV、ASFV的DNA和PRRSV、CSFV的cDNA為模板，用兩對特異性引物分別對各模板進行PCR擴增，結果只有以ASFV和CSFV的核酸為模板的PCR反應才能擴增出相應的條帶，與其它模板沒有任何擴增產物，表明該法特異性良好。見圖4。

2.4 敏感性試驗

分別將ASFV和CSFV的質粒進行10倍梯度稀釋，將稀釋倍數相同的質粒等比例混合后作為PCR反應模板，按已優化的最佳條件，用兩對特異性引物分別對各模板進行PCR擴增，可知該雙重PCR最低可檢測到100pg的DNA。其結果見圖5。

圖5 M：DNA分子質量標準；

1~6依次為10-1~10-6倍稀釋的質粒擴增結果

2.5 臨床檢測結果

應用已建立的雙重PCR方法對山東聊城地區某豬場采集的58份樣品進行檢測，其中豬瘟陽性病料15份，非洲豬瘟陽性病料0份。用單一PCR復檢，結果一致，說明該方法準確性較高。

3 討論

PCR技術檢測ASFV具有快速、靈敏及特異性強的特點，并且可以檢測出各種樣本(血液、糞便、分泌物、組織切片)中ASFV的遺傳物質DNA，從而實現早期診斷。另外，PCR選擇擴增的區域位于基因組的保守區，因此可用于不同ASFV株的檢測，并且其結果準確易解釋，特別是具有生物安全性，沒有任何散毒的危險，因此越來越廣泛地用于ASFV病原的檢測[7]。

本試驗檢測結果中的15例豬瘟陽性病料有5份來自死豬，10份來自活豬，經調查發現該豬場曾免疫過豬瘟疫苗，通過抗體檢測發現效價不高，說明免疫效果并不理想，這可能與近幾年豬瘟流行特點趨向于非典型性，溫和性相關，也有可能是豬群存在其他的免疫抑制性疾病導致免疫失敗，希望養殖戶們在引進豬群時做好隔離檢查，采用科學嚴格的飼養模式，預防為主，防治結合。

[l] 殷震, 劉景華. 動物病毒學第2版[M]. 北京: 科學出版社. 1997: 652-653.

[2] 吳增堅, 楊奎. 非典型豬瘟[J], 畜牧與獸醫, 2000, 32(2): 35-36.

[3] 孫懷昌. 非洲豬瘟病毒研究進展[J]. 中國預防獸醫學報, 2006. 28(1): 117-120.

[4]Carmina G. Dufton M M, Joseph M M。et a1. Enhanced discrimination of African swine fever virus isolates through nucleotide sequencing of the p54, p72. and pB602L(CVR)[J]. Virus Genes, 2009, 38: 85-95.

[5] Boshoff C I, Bastos A D, Gerber L G, et a1. Genetic characterisation of African swine fever viruses from outbreaks in southern Africa(1973-1999)[J]. Vet Microbiol, 2007, 121: 45-55.

[6] OIE. African swine fever. In Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals[M]. Office International des Epizooties: Paris France, 2008 l 1069-1082.

[7] Penrith M L, Lopes P C. Lopes da S M, et a1. African swine fever in Mozambique: review, risk factors and considerations for control[J]. Onderstepoort J Vet Res, 2007, 74(2): 149-160.

（2012–07–20）

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1007-1733(2012)11-0007-03