HPLC法測定乳癖散結顆粒中迷迭香酸的含量

王云霞 王敏春 謝志民 西安市食品藥品檢驗所（西安710054）

乳癖散結顆粒是國家食品藥品監督管理局2008年批準生產的新劑型，由夏枯草、川芎、僵蠶、鱉甲、柴胡、赤芍、玫瑰花、莪術、當歸、延胡索、牡蠣等11味藥材組成，原標準無含量控制方法。夏枯草為方中君藥，以往資料多采用高效液相色譜法、氣相色譜法、薄層掃描法或毛細管電泳法測定其齊墩果酸或熊果酸的含量，作為其質量控制方法；近年來有以高效液相色譜法測定其迷迭香酸的含量，作為其質量控制方法［1－3］，均使用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑。本文使用極性乙醚連接苯基鍵合硅膠柱，采用HPLC方法測定其所含迷迭香酸的含量，作為成方制劑的質量控制方法。

1 儀器與試藥 1.1儀器 島津LC－2010AHT型高效液相色譜儀、LC－solution色譜工作站，北京普析通用分析儀器有限責任公司TU－1800PC型紫外－可見分光光度計。

1.2 試劑與試藥 迷迭香酸對照品由中國藥品生物制品檢定所提供（批號：111871－201001，供含量測定用），乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為雙蒸水，乳癖散結顆粒樣品為陜西白鹿制藥股份有限公司提供，陰性樣品、模擬低濃度樣品、模擬高濃度樣品均自制。

2 方法與結果 2.1 色譜條件與系統適用性試驗 Phenomenex Synergi極性乙醚連接苯基鍵合硅膠柱（4μm，250mm×4.60mm），柱溫30℃，檢測波長為330nm，流速1.0mL／min－1，采用乙腈－0.1%磷酸梯度洗脫，時間程序見下表。

表1 時間程序表

在此條件下，樣品得到良好分離，二極管陣列檢測結果證明樣品峰紫外吸收與對照品峰一致，夏枯草陰性對照樣品在迷迭香酸峰處無峰出現，不干擾本品的測定。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取迷迭香酸對照品10.01mg，置25mL量瓶中，加甲醇使溶解，并加至刻度，搖勻，作為6號對照品溶液，精密吸取6號對照品溶液1mL 5份，分別置5mL、10mL、25mL、50mL和100mL量瓶中，加乙腈－0.1%磷酸（20：80）的混合溶液至刻度，搖勻，分別作為5～1號對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備 取重量差異項下的本品，研細（過3號篩），精密稱取粉末2g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇－甲酸（100：3.5）的混合溶液25mL，稱定重量，加熱回流1h，放冷，再稱定重量，用上述混合溶液補足減失的重量，搖勻，置冰箱中冷藏2h，取出，濾過，棄去初濾液，取續濾液作為供試品溶液。

2.4 標準曲線與線性范圍 按2.1中方法，精密吸取1～6號對照品溶液10μL（6號增加一15μL，1號增加一5μL），各進樣2次，測定峰面積。以峰面積平均值為縱坐標，以進樣量（μg）為橫坐標，計算得回歸方程 Y＝3E＋06X－7110.2，r＝0.99992，表明在該系統條件下，迷迭香酸進樣量在0.02ug～6.0ug范圍內，峰面積積分值與進樣量呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗 精密吸取2.2項1、3、5號對照品10uL，各進樣5次，按上述條件測定峰面積，結果RSD均小于1%。表明本方法進樣量在0.04ug～0.8ug范圍內進樣精密度良好。

2.6 重復性試驗 精密稱取模擬1號樣品（低濃度）、050828號樣品和模擬2號樣品（高濃度）2g，各3份，共9份，按照2.3項方法制備供試品溶液。精密吸取各供試品溶液和2.2項下2、3、5號對照品溶液各10μL，注入液相色譜儀，按2.1項下的條件測定迷迭香酸色譜峰面積，計算，結果表明樣品每袋含迷迭香酸在0.45mg～3.96mg范圍內，測定結果的RSD為0.2%～1.27%。

2.7 穩定性試驗 取2.6中批號為050828的供試品溶液，按2.1項下方法，分別于0h、2h、4h、8h、12h、16h、20h和24h測定峰面積，結果峰面積RSD為0.43%，顯示供試品溶液在24h內穩定。

2.8 回收率試驗 精密稱取迷迭香酸對照品12.02mg，置25mL量瓶中，加甲醇使溶解，并加至刻度，搖勻，作為Ⅰ號對照品溶液。精密吸取Ⅰ號對照品溶液3mL2份，分別置5mL和10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，分別作為Ⅱ、Ⅲ號對照品溶液。分別精密稱取模擬1號樣品粉末、050828號樣品粉末、模擬2號樣品粉末1g，各3份，共9份，分別置具塞錐形瓶中。模擬1號樣品分別精密加入III號對照品溶液1mL、050828號樣品分別精密加入Ⅱ號對照品溶液1mL、模擬2號樣品分別精密加入Ⅰ號對照品溶液2mL，分別精密加入50%甲醇－甲酸（100：3.5）溶液各25mL，按2.3中方法制備供試品溶液，以2.1中條件測定含量，計算回收率，結果（見表2）表明每袋含迷迭香酸在0.45mg～3.96mg范圍內平均加樣回收率為100.38%，RSD為1.35%～1.99%。

表2 迷迭香酸加樣回收實驗（n＝9）

2.9 樣品含量測定 精密稱取6批樣品各2g， 按2.3中方法制備溶液，以2.1中條件測定含量，結果6批樣品含量為0.86mg／袋～1.71mg／袋（見表3），RSD為0.04%～1.04%。

表3 各批次測定情況表

3 討 論 3.1 研究過程中采用正交實驗的方法對回流時間、甲酸的加入量等影響因素進行了考察 結果表明，回流時間和甲酸加入量對實驗結果有顯著影響，以50%甲醇－甲酸（100：3.5）為提取溶劑，回流1h為最佳。

3.2 樣品溶液制備過程中發現 溶液放冷補重后直接濾過比較難，將此溶液置0～4℃冰箱中冷藏2h后較易濾過，不影響迷迭香酸的測定結果。

3.3 研究過程中同時對乳癖散結片和乳癖散結膠囊作了方法適用性研究 證明本法對乳癖散結片和乳癖散結膠囊中迷迭香酸的含量測定亦有良好的適用性。

3.4 系統耐用性試驗 結果證明不同品牌的色譜柱、不同檢測波長（326nm～334nm）、不同流動相比例（乙腈占18%～20%）、不同柱溫（30℃～35℃）、不同流速（1.0mL／min～1.2mL／min）條件下迷迭香酸峰分離良好、峰形對稱，均可用于迷迭香酸的含量測定。

［1］國家藥 典委員會.中國藥典［S］.一部.北京：化學工業出版社，2010：197.

［2］王祝舉，趙玉英，王 頒，等.夏枯草中迷迭香酸含量分析方法研究［J］.藥物分析雜志，2006，26（3）：399.

［3］張蘭珍，秦 雯，張小華，等.夏枯草不同部位中咖啡酸和迷迭香酸的含量測定方法研究［J］.北京中醫藥大學學報，2007，5：9.