牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用

陳其兵，薛 霜，漆世華，朱 薇，張 萍，謝紅玲，溫文生，吳玉石

(武漢中博生物股份有限公司，武漢 430070)

牛病毒性腹瀉病(bovine viral diarrhea，BVD)是一種在世界范圍內(nèi)廣泛傳播的牛羊傳染病，其病原為黃病毒科瘟病毒屬的牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)。BVDV 是危害養(yǎng)牛業(yè)、養(yǎng)羊業(yè)和養(yǎng)豬業(yè)的重要病原之一，能引起感染動(dòng)物產(chǎn)生以腹瀉為主的一系列復(fù)雜的臨床癥狀[1-3]。BVDV 感染可發(fā)生于子宮內(nèi)[4]，垂直感染使得胎牛血清、豬瘟細(xì)胞疫苗等很難控制BVDV污染，給畜牧業(yè)及相關(guān)生物制品領(lǐng)域造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。

檢測(cè)BVDV的方法很多，主要包括血清學(xué)中和試驗(yàn)、細(xì)胞分離培養(yǎng)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、PCR技術(shù)等。血清學(xué)方法多存在費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、準(zhǔn)確率低等缺點(diǎn)。我國(guó)診斷BVDV國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)采用培養(yǎng)細(xì)胞分離病毒的方法，但該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，加之病毒分離率低，有些非致細(xì)胞病變型BVDV在細(xì)胞培養(yǎng)中不出現(xiàn)細(xì)胞病變，因而不利于大規(guī)模應(yīng)用檢測(cè)[5-6]。近幾年發(fā)展起來的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)將傳統(tǒng)PCR與熒光檢測(cè)方法相結(jié)合，具有操作簡(jiǎn)便、結(jié)果直觀、敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，已成為病原檢測(cè)的重要方法。本研究建立了一種特異性的BVDV熒光定量RT-PCR快速檢測(cè)方法，可用于BVDV的臨床輔助診斷、快速定量檢測(cè)以及對(duì)生物制品中是否污染BVDV進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 生物材料 牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒、豬瘟疫苗毒、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒、MDBK細(xì)胞、胎牛血清由武漢中博生物股份有限公司保存，大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物公司。

1.1.2 主要試劑 BamHⅠ限制性內(nèi)切酶、TaqDNA聚合酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNase Inhibitor、DNaseⅠ、T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA 片段回收純化試劑盒、質(zhì)粒快速提取試劑盒、病毒核酸提取試劑盒、熒光定量RT-PCR試劑盒(探針法)均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，pEASY-T1克隆載體購(gòu)自北京全式金公司。

1.2 方法

1.2.1 引物及探針設(shè)計(jì) 通過分析BVDV的保守基因片段，并結(jié)合熒光PCR引物探針設(shè)計(jì)特點(diǎn)，利用DNAStar軟件進(jìn)行同源性排序分析比較，選出在BVDV 5’UTR序列中種內(nèi)保守種間特異的核苷酸片段，然后利用Primer Express及DNAStar軟件設(shè)計(jì)篩選出最佳引物和探針組合，確定為本方法中所使用的引物和探針。

1.2.2 定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備

1.2.2.1 體外轉(zhuǎn)錄模板的制備 以提取的BVDV核酸為模板擴(kuò)增目的基因片段，經(jīng)回收純化后將其連接至pEASY-T1載體上。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過抗性篩選、擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。將經(jīng)PCR初步鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒送生物公司測(cè)序鑒定并及時(shí)保存陽(yáng)性菌液和質(zhì)粒。

1.2.2.2 體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)準(zhǔn)品 將構(gòu)建的陽(yáng)性重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ酶切使質(zhì)粒線性化，T7 RNA聚合酶37℃體外轉(zhuǎn)錄2 h，DNaseⅠ消化去除模板 DNA，酚/氯仿/異戊醇抽提純化RNA，置于-70℃保存?zhèn)溆谩＝?jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定含量(連續(xù)測(cè)定5次取平均值)，計(jì)算出每微升所含的拷貝數(shù)并進(jìn)行10倍梯度稀釋，作為定量標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.3 熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立

1.2.3.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化 根據(jù)寶生物One Step PrimeScript RT-PCR試劑盒說明書，用所制備的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)PCR反應(yīng)條件和體系進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.3.2 特異性實(shí)驗(yàn) 在相同的條件下，同時(shí)對(duì)未接毒的MDBK細(xì)胞、牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒、豬瘟疫苗毒和豬繁殖與呼吸綜合癥病毒提取核酸。應(yīng)用優(yōu)化后的PCR體系及條件對(duì)上述樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)以定量標(biāo)準(zhǔn)品和無菌水分別作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照，驗(yàn)證所建立檢測(cè)方法的特異性。

1.2.3.3 敏感性試驗(yàn) 以10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進(jìn)行RT-PCR，得到相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定最低檢出量。

1.2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 用所建立的方法對(duì)3組不同病毒含量的樣品進(jìn)行重復(fù)性測(cè)定，所得檢測(cè)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后，計(jì)算組內(nèi)的變異系數(shù)(CV)。

1.3 臨床樣品的檢測(cè) 用所建立的方法對(duì)10份胎牛血清樣品和10份豬瘟細(xì)胞苗半成品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)設(shè)立陰、陽(yáng)性對(duì)照，計(jì)算陽(yáng)性檢出率。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 引物、探針設(shè)計(jì) 通過分析BVDV-Ⅰ型的保守基因片段，并結(jié)合熒光PCR引物探針設(shè)計(jì)特點(diǎn)，利用DNAStar軟件進(jìn)行同源性排序分析比較，選出在5’UTR序列中種內(nèi)保守種間特異的核苷酸片段，然后利用Primer Express及DNAStar軟件設(shè)計(jì)篩選出最佳引物和探針組合，確定為本方法中所使用的引物和探針(表1)。

表1 BVDV熒光定量RT-PCR引物和探針

2.2 反應(yīng)條件優(yōu)化 經(jīng)相關(guān)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為:2×One Step RT-PCR BufferⅢ10 μL、10 μM TaqMan 探針 0.4 μL、10 μM 上游引物 0.4 μL、10 μM 下游引物 0.4 μL、TaKaRa Ex Taq HS 0.4 μL、Prime-Script RT Enzyme MixⅡ 0.4 μL、Rox Reference Dye 0.4 μL、DEPC H2O 5.6 μL、模板 2 μL。

擴(kuò)增條件為:42℃ 5 min，95℃ 10 s，1個(gè)循環(huán);95℃ 5 s，60℃ 40 s(收集熒光FAM)，40個(gè)循環(huán)。

2.3 特異性試驗(yàn) 結(jié)果顯示，牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒和陽(yáng)性對(duì)照品檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，而豬瘟細(xì)胞毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、MDBK細(xì)胞和陰性對(duì)照品均為陰性(圖1)。證明所建立的方法能特異性的檢測(cè)出牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒。

圖1 特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 敏感性試驗(yàn) 以十倍系列稀釋的BVDV轉(zhuǎn)錄RNA標(biāo)準(zhǔn)品(2.15×102～2.15×108拷貝/μL)作為模板進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，在2.15×102～2.15×108拷貝/μL的范圍內(nèi)可以得到良好的動(dòng)力學(xué)曲線(圖2)且標(biāo)準(zhǔn)曲線較為理想(圖3)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)(R2)在0.99以上，提示誤差較小，可信度較高。說明本方法可檢測(cè)低至103～104拷貝/mL的病毒量。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 所得檢測(cè)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后，計(jì)算組內(nèi)的變異系數(shù)(CV)，結(jié)果顯示CV值均小于3%，說明差異不顯著，該檢測(cè)方法重復(fù)性較好(表2)。

表2 樣品組間重復(fù)性檢測(cè)

2.6 臨床樣品的檢測(cè) 在所檢測(cè)20份樣品中，其中胎牛血清樣品BVDV陽(yáng)性4份(4/10)，豬瘟細(xì)胞苗半成品BVDV陽(yáng)性2份(2/10)。陽(yáng)性檢出率為30%，且陰、陽(yáng)性對(duì)照均成立，檢測(cè)結(jié)果見圖4。

圖4 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

3 討論

牛病毒性腹瀉病至今仍是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展的傳染病，世界各國(guó)對(duì)該病都十分重視，對(duì)其展開的研究力度逐年都在增加，近幾年來我國(guó)牛感染BVDV并持續(xù)帶毒的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生[7]。由于BVDV與豬瘟病毒同屬于黃病毒科瘟病毒屬的成員，具有較近的親緣關(guān)系，兩者的氨基酸同源性約為85%[8]，在血清學(xué)上存在交叉反應(yīng)，因而血清學(xué)方法難以區(qū)分BVDV和CSFV。在生產(chǎn)豬瘟細(xì)胞疫苗的過程中會(huì)用到胎牛血清、牛睪丸細(xì)胞等牛源制品，一旦這些制品中污染了BVDV，便會(huì)造成豬瘟細(xì)胞疫苗的污染。據(jù)相關(guān)報(bào)道，豬使用污染了BVDV的豬瘟疫苗后可感染BVDV，出現(xiàn)類似于豬瘟的臨床癥狀和病理變化。另外，用含BVDV抗原和抗體的牛血清也會(huì)干擾豬瘟病毒的體外培養(yǎng)[9]。因而建立特異敏感的BVDV檢測(cè)方法，有利于保障牛血清、豬瘟細(xì)胞活疫苗等的質(zhì)量。

目前BVDV的診斷技術(shù)研究水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于其他方面的研究進(jìn)展，如何建立快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法是當(dāng)前BVDV防制工作的迫切要求。實(shí)時(shí)定量PCR方法操作簡(jiǎn)便、快速高效、具有較高的敏感度和特異性，而且封閉性好、不需要后續(xù)處理，大大降低了污染的可能性。顯著的優(yōu)越性使得該方法不僅在生物技術(shù)方面應(yīng)用廣泛，現(xiàn)今更作為一種診斷方法應(yīng)用于臨床。本研究建立了一種能夠快速、特異、靈敏的檢測(cè)BVDV的熒光定量RT-PCR方法，通過對(duì)20份胎牛血清和豬瘟細(xì)胞疫苗樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中6份樣品污染了BVDV(6/20)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)所建立的檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、快捷，具有較好的特異性、敏感性且重復(fù)性好。可用于臨床及科研中對(duì)BVDV的快速定量檢測(cè)和對(duì)牛血清及豬瘟兔化弱毒疫苗等生物制品中是否污染BVDV進(jìn)行監(jiān)測(cè)。但本研究中的引物和探針序列是根據(jù)BVDV-Ⅰ型設(shè)計(jì)的，豬瘟疫苗中是否有BVDV-Ⅱ型毒株的污染尚需用多種方法進(jìn)一步檢測(cè)才能確定。

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